Nat Comm︱于强/陈清烽团队合作揭示三阴性乳腺癌缺氧微环境诱导免疫效应细胞失活以及PD-1抑制剂耐药的新机制

撰文︱马世骏

责编︱王思珍，方以一

编辑︱方以一

三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是一种恶性肿瘤，致死率高，预后极差，易复发。PD-1抑制剂作为新兴的免疫疗法，于2021年被批准应用于TNBC的治疗，但结果仍不尽人意。大部分TNBC病人对PD-1抑制剂依然有较高的抗性[1, 2]。

缺氧是TNBC的重要特征之一。近期有临床研究表明，缺氧微环境与肿瘤的免疫逃逸以及对免疫疗法的抗性有重要的关联[3, 4]。但缺氧如何影响肿瘤免疫环境及其机理尚不明确。揭示缺氧环境如何影响免疫效应细胞 （如CD8 T细胞、NK细胞）及其作用机制，寻找有关的药物靶点以客服免疫逃逸具有重要的临床意义。

2022年7月，新加坡基因所于强课题组以及新加坡分子与细胞生物研究所陈清烽课题组合作在Nature Communications发表了题为“Hypoxia induces HIF1α-dependent epigenetic vulnerability in triple negative breast cancer to confer immune effector dysfunction and resistance to anti-PD-1 immunotherapy”的研究，揭示了缺氧环境通过缺氧诱导因子HIF1-α调节免疫细胞因子如干扰素Interferon gamma（IFN-γ）表达的表观遗传学机制，提出了靶向抑制HIF1-α或相关表观遗传调控因子以协同增强PD-1抑制剂的新型TNBC治疗方案。

作者先利用在线数据库[5]对人类乳腺癌RNA测序数据进行了分析， 发现在TNBC肿瘤样本中缺氧标志基因的表达与T细胞与NK细胞的标志基因，免疫效应基因（如 IFNG），免疫应答基因都呈现明显的负相关（图1）。对人体TNBC肿瘤切片的免疫荧光分析，确认了缺氧微环境既能减少CD8 T细胞对TNBC肿瘤的侵润，也能弱化CD8 T细胞的活性，降低免疫细胞因子IFN-γ的表达（图1）。

图1 在线数据库分析与人体TNBC切片的免疫荧光分析

（图源：Ma S, et al., Nat Commun, 2022）

为研究缺氧微环境对免疫效应细胞的直接影响以及模拟体内肿瘤的微环境，作者建立了抗原识别T细胞与抗原性TNBC细胞株的共培养平台，并对缺氧环境以及有氧环境下的CD8 T细胞进行对比。对共培养中的CD8 T细胞的RNA测序分析以及对CD8 T细胞和NK细胞的流式分析显示了缺氧可以直接导致免疫细胞因子，如IFN-γ和TNF-α的大幅度降低，以及耗竭T细胞标记蛋白LAG3，TIM-3和TIGIT的高表达（图2）。

图2 体外T细胞与TNBC细胞共培养模型；共培养模型中CD8 T细胞的RNA测序以及流式分析；NK细胞数据可参照原文辅助数据

（图源：Ma S, et al., Nat Commun, 2022）

随后的靶向药物筛选以及分子机理的研究显示，缺氧环境导致CD8 T细胞以及NK细胞中HIF1-α蛋白水平上升。HIF1-α蛋白可以与表观遗传调控蛋白HDAC1结合并共同结合到细胞因子如IFN-γ 的基因IFNG的启动子位点。HIF1-α-HDAC1蛋白复合体随即与另一表观遗传蛋白复合体PRC2共同作用，调节该区域的组蛋白修饰，从而抑制细胞因子的表达（图3）。

图3 ChIP-qPCR数据显示HIF-1α与HDAC1在缺氧状态下共同结合在IFNG 启动子位点，与原本结合在该处的PRC2 复核体（包括EZH2与SUZ12）共同调节缺氧状态下的组蛋白位点H3K27 修饰

（图源：Ma S, et al., Nat Commun, 2022）

作者随后在体外模型中，验证了药物靶向抑制HIF1-α、HDAC1或PRC2(EZH2) 能够有效地提高缺氧状态下CD8 T 细胞以及NK细胞的免疫因子表达以及对肿瘤细胞的杀伤（图4）。在随后的小鼠模型中，HIF1-α抑制剂PX478以及HDAC抑制剂Entinostat （ENT）能够克服小鼠TNBC模型4T1肿瘤对于PD-1抑制剂的抗性。流式分析显示，PX478+PD-1抑制剂以及ENT+PD-1抑制剂有效地改善4T1肿瘤的免疫微环境，抑制免疫逃逸（图5）。

图4 HIF-1α 抑制剂PX478与Digoxin（Dig），HDAC1抑制剂Entinostat（ENT）以及EZH2抑制剂EPZ6438 （EPZ）在体外模型中恢复缺氧状态下CD8T细胞的IFN-γ表达和对肿瘤细胞的杀伤

（图源：Ma S, et al., Nat Commun, 2022）

图5 HIF-1α抑制剂PX478 与HDAC抑制剂ENT 与PD-1抑制剂在小鼠TNBC模型中有协同增效作用

（图源：Ma S, et al., Nat Commun, 2022）

为进一步验证PX478+PD-1抑制剂以及ENT+PD-1抑制剂在临床应用的潜力，陈清烽团队利用人体干细胞移植技术建立了人源小鼠模型，在小鼠中构建了人体免疫系统，包括健康的人体T细胞与NK细胞（图6）。在人源小鼠模型中，人类TNBC模型231-LM2 肿瘤对于人体PD-1抑制剂Keytruda有极高的抗性。HIF1-α抑制剂PX478以及HDAC1抑制剂ENT同样克服了人类TNBC模型对Keytruda的抗性，具有明显的协同增强作用（图6）。

图6 PX478+Keytruda与ENT+Keytruda 在人源小鼠模型中的作用

（图源：Ma S, et al., Nat Commun, 2022）

图7 缺氧抑制免疫效应细胞活性的分子机制

（图源：新加坡基因所于强实验室）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究揭示了三阴性乳腺癌（TNBC）缺氧微环境抑制免疫效应细胞活性的作用机制，首次发现了免疫效应细胞中缺氧诱导蛋白HIF1-α与表观遗传调节蛋白HDAC1通过结合成共同体的形式，直接作用于免疫细胞因子基因组蛋白修饰的分子机理模型。并在此基础上确认了HIF1-α与HDAC1作为新的药物靶点，以克服TNBC的免疫逃逸，增强TNBC对PD-1抑制剂的反应（图7）。值得一提的是，缺氧环境降低了免疫效应细胞的细胞因子同时提高了T细胞耗竭标记蛋TIM-3，LAG-3和TIGIT的表达。靶向抑制HIF1-α与HDAC1虽然提高了细胞因子表达，增强了免疫效应细胞活性，但对T细胞耗竭标记蛋白没有影响。缺氧环境如何影响T细胞耗竭仍不完全明确，有待进一步的研究。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-31764-9

该论文的通讯作者为新加坡基因所于强博士与新加坡分子与细胞生物研究所陈清烽博士。本文第一作者为马世骏博士。

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[5] Comprehensive molecular portraits of human breast tumours, Nature, 490 (2012) 61-70.

本文完