STAR Protocols︱蒋晞课题组优化急性髓系白血病小鼠模型建立及监测方法
撰文︱陆 君
责编︱王思珍，方以一
编辑︱方以一
急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是最常见的急性白血病类型，其特点是髓系祖细胞恶性增殖，同时正常造血功能受到抑制[1]。混合谱系白血病（mixed lineage leukemia，MLL）基因是婴儿和成人白血病中染色体易位和重排的常见靶点。AML伴MLL融合往往预后不良，对目前大多数临床化疗均有耐药性[2, 3]。常见的MLL重排，诸如MLL-AF4、MLL-AF9、MLL-AF10、MLL-ENL，都有明确的致癌性[4]。因其强大的致病性，MLL相关融合基因可用于构建小鼠AML在体模型。稳定、可监测的小鼠AML疾病模型对AML相关研究有着重大意义。
近期，浙江大学基础医学院/浙江大学医学院附属第一医院蒋晞课题组在《Cell》子刊《STAR Protocols》上发表了题为“Protocol to establish a stable MLL-AF9_AML mouse model”的实验方案文章（Protocol）。该文章优化了小鼠AML疾病模型建立的实验方法，通过逆转录病毒感染和两次骨髓移植（bone marrow transplantation，BMT），建立了较为稳定的小鼠MLL-AF9_AML疾病模型，并对白血病进程进行了全程监测。该模型也适用于构建其他亚型AML，并可用于AML药物干预和/或其他干预。蒋晞课题组已应用此模型进行了AML遗传学和表观遗传的多项研究，发表多篇研究论文[5-8]。
在此项工作中，作者详细介绍了MLL-AF9_AML小鼠模型建立和病程监测的完整方法（图1）。作者选用B6.SJL（CD45.1）小鼠作为供体，并提前5天注射150 mg/kg 5-氟尿嘧啶，以保证获得足够的小鼠造血干细胞/前体细胞（hematopoietic stem/progenitor cells，HSPCs）。接下来，作者用携带MLL-AF9基因的逆转录病毒转染HEK293T细胞所产生的病毒液感染从CD45.1供体小鼠骨髓中分选得到的HSPCs。为提高病毒对HSPCs的感染效率和细胞活率，作者进行了两次感染操作，之后进行5-10天药物筛选，并密切监测细胞密度和状态。
图1 小鼠AML模型建立及监测的实验方案
（图源：Jun L et al., STAR Protoc, 2022）
第一代骨髓移植（bone marrow transplantation，BMT）以接受960 rads全剂量辐照的C57BL/6 （CD45.2）小鼠作为受体。作者将转染后的CD45.1 MA9供体细胞混以适量野生型辅助细胞，通过尾静脉注射的方式完成骨髓移植。当小鼠发病后，收集白血病小鼠的骨髓细胞作为二代移植的供体细胞。二代BMT的受体CD45.2小鼠须接受480 rads半剂量辐照，当小鼠白血病发生后，可以进行药物处理或其他干预。为提高受体小鼠存活率，作者在收集供体细胞时，将细胞液通过40 μm细胞网筛以去除较大细胞团块，并在BMT后1-2周内给予受体小鼠必要的辅助照料，例如抗生素水、鼠粮等。小鼠发病后，作者收集了受体小鼠外周血、脾、骨髓等病理样品，与对照相比，受体小鼠外周血中白细胞数量明显增多（图2A），脾的重量和体积明显增加（图2B-C），受体小鼠表现出明显的白血病症状。
图2 BMT受体小鼠外周血白细胞计数与脾重
（图源：Jun L et al., STAR Protoc, 2022）
同时，作者采用流式细胞术进行病程监测。作者收集受体小鼠外周血或骨髓细胞，检测其中CD45.1+细胞百分比，计算供体细胞移植率。结果显示，一代BMT移植率高于85%，二代BMT移植率可达95%以上（图3）。与对照相比，受体小鼠骨髓细胞CD11b、Gr-1阳性细胞百分比明显减少（图4），提示MLL-AF9_AML小鼠骨髓细胞分化受阻。
图3 BMT受体小鼠移植率
（图源：Jun L et al., STAR Protoc, 2022）
图4 BMT受体小鼠BM细胞分化情况
（图源：Jun L et al., STAR Protoc, 2022）
原文链接：https://star-protocols.cell.com/protocols/1845
浙江大学基础医学院/浙江大学医学院附属第一医院蒋晞研究员为本论文通讯作者，浙江大学医学院博士生陆君、博士生赵焕焕为本文共同第一作者。本文得到浙江大学医学院的技术支持，以及国家自然科学基金项目(no . 31900426、81970144)的经费支持。
通讯作者：蒋晞
（照片提供自：蒋晞实验室）
课题组简介
现因实验室发展需要，诚聘博士后2-3名、科研助理1-2名，热忱欢迎优秀的青年学者加盟！
【1】Cell Death Differ︱杨铁林团队揭示染色质三维结构与表观重塑促进干细胞命运转变
【2】STAR Protocols︱贾琼团队发表二维和三维细胞外基质刚性调控及致瘤细胞筛选方案
【3】Cell Death Dis︱袁凌青团队揭示血管钙化新作用机制：血管壁微环境中内皮细胞分泌的外泌体调控尿毒症动脉中膜钙化
【4】CII︱郭志刚团队联合蓝盾生物开发靶向间皮素CAR-T新药治疗卵巢癌
【5】Cell Death Dis︱杨锦建/贾占奎团队新研究证实AOC1有望成为前列腺癌治疗的新靶点
【6】Front Immunol︱姜春来/张勇团队发现肌内接种AS02佐剂呼吸道合胞病毒亚单位疫苗展现出更好的免疫效果和安全性
【7】Nat Commun︱程亦凡团队运用融合蛋白策略和冷冻电镜技术成功解析G蛋白偶联受体非激活构象
【8】Cell Death Differ︱秦仁义团队发现去泛素化酶USP14有望成为治疗胰腺癌的新靶点
参考文献（上下滑动阅读）
[1] Döhner, H., D.J. Weisdorf, and C.D. Bloomfield, Acute Myeloid Leukemia. N Engl J Med, 2015. 373(12): p. 1136-52.
[2] Krivtsov, A.V. and S.A. Armstrong, MLL translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer, 2007. 7(11): p. 823-33.
[3] Rowley, J.D., Chromosomal translocations: revisited yet again. Blood, 2008. 112(6): p. 2183-9.
[4] Marschalek, R., MLL leukemia and future treatment strategies. Arch Pharm (Weinheim), 2015. 348(4): p. 221-8.
[5] Zhao, H., et al., Opioid receptor signaling suppresses leukemia through both catalytic and non-catalytic functions of TET2. Cell Rep, 2022. 38(4): p. 110253.
[6] Jiang, X., et al., Targeted inhibition of STAT/TET1 axis as a therapeutic strategy for acute myeloid leukemia. Nat Commun, 2017. 8(1): p. 2099.
[7] Jiang, X., et al., miR-22 has a potent anti-tumour role with therapeutic potential in acute myeloid leukaemia. Nat Commun, 2016. 7: p. 11452.
[8] Jiang, X., et al., MiR-495 is a tumor-suppressor microRNA down-regulated in MLL-rearranged leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(47): p. 19397-402.
本文完