PNAS︱高阳团队揭示DNA解旋酶易位机制

撰文︱金石开

责编︱王思珍，方以一

编辑︱方以一

DNA解旋酶（helicase）是DNA复制过程中必不可少的一种蛋白，其主要功能是利用核苷酸水解过程中产生的能量在DNA上运动，并在运动过程中分开DNA的两条核酸长链，从而开启后续新核酸链的合成。目前，临床上针对如COVID-19等多种病毒解旋酶功能的药物正在研究。其中，噬菌体T7的解旋酶gp4是理解六元化解旋酶易位机制的模式体系。因此，深入认识并阐明解旋酶的易位机制有助于我们理解整个DNA复制过程中蛋白质的协同作用。

2022年8月6日，美国莱斯大学高阳教授团队和Peter Wolynes教授团队联合在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上发表了题为“Computationally exploring the mechanism of bacteriophage T7 gp4 helicase translocating along ssDNA”的研究。该研究基于粗粒化分子动力学模拟分析并推测出DNA解旋酶gp4的易位的中间态以及相关的运动机制。该研究对于gp4蛋白质的机制进行了进一步的剖析，弥补了目前实验手段观测精度受限的不足。Peter Wolynes课题组的博士生金石开为文章第一作者。

在DNA复制过程中，解旋酶处于复制叉的最前端，与DNA聚合酶、单链结合蛋白等发生直接作用。解旋酶总共有6个不同的超家族，1类和2类超家族以单体形式作用，剩下的3-6类超家族以六聚体形式作用。噬菌体T7 gp4解旋酶属于第4类超家族，沿核酸单链5´-3´的方向运作。六聚体中每个单体上的DNA结合区域和单链DNA互作并形成一个螺旋楼梯的结构附着在DNA骨架上。现有的实验已知gp4可以用dTTP和ATP水解的能量来驱动运动，但是这些能量如何转化成蛋白质大规模的变化仍然不得而知。

研究者使用分子动力学模拟的方法来对整个易位过程进行模拟。文章在原先已有的AWSEM-3SPN2C的力场上搭建出了一个新的蛋白质与单链DNA相互作用的力场并针对单链DNA的特性进行了校准。为了能够有效地捕捉蛋白质结构在易位过程中的动态变化，我们引入了Qdiff这样一个指标和最大主成分来绘制二维的能量地形图（图1）。Qdiff用于衡量蛋白质在两个状态之间的氨基酸接触（residue contact）的变化。分子动力学模拟的起始坐标来自高阳教授之前的Science文章所解析出的冷冻电镜结构，包括起始和终末两个状态[1]。之前的生化实验证实在易位过程中，位于两个亚基的交界处的ATP会水解，然后其中一个亚基用手牵手交互移动方式（hand-over-hand）向DNA的3´端前进一大步（共24埃米），之后会在新的交界处引入一个新的ATP分子。本文通过引入两个交界处不同的ATP状态变化来比较相应的能量差距。

研究者以亚基F的位移为例，发现在旧的界面E/F中，ATP的引入会造成巨大的能量壁垒阻止F亚基易位。但是，如果将ATP/ADP分子移除，则该区域不会有任何的局部极小值，意味着该种状态下蛋白质最易发生易位（图1B, D, F）。在新的界面A/F中，没有ATP分子的情况下蛋白质的能量全景图在中间态中存在一个巨大的能垒，导致无法顺利完成易位过程。而引入ATP分子则可以降低中间态的能垒（图1C, E）。

图1 易位过程中不同ATP、ADP及apo形态的组合显示出不同的局部能量最低点

（图源：Jin S, et al., PNAS, 2022）

紧接着，研究者对于这一现象进行进一步的探索，他们发现在易位过程中蛋白质存在一个高正电荷而引起静电力互斥的表面，而ATP的引入可以降低这个表面的互斥静电力从而使结构更加稳定（图2）。对蛋白质与ATP结合的氨基酸的相对角度进行分析后，研究者对于局部能量最小的区域之间的转换过程有了合理的解释。在IM2和IM3区域之间，蛋白质通过调整两个亚基之间的角度来更加稳定并完成易位过程。研究者还发现了蛋白质的其中一个环区D2对于整个过程中蛋白质的移动方向起到作用而不至于使要移动的亚基脱离DNA的骨架（图3）。

图2 蛋白质表面静电力势场的变化显示ATP的引入可以稳定对应亚基之间的相互作用

（图源：Jin S, et al., PNAS, 2022）

图3 环区D2在蛋白质易位过程中起关键作用；通过持续的蛋白质与DNA骨架的相互作用，环区D2保证整个亚基不会飘离DNA骨架。

（图源：Jin S, et al., PNAS, 2022）

文章的最后，研究人员根据每个局部最小区域的代表结构绘制出了一份示意图（图4），表示出了不同状态下蛋白质亚基之间的相互作用。通过比较亚基之间中心的角度，研究人员推测出整个过程主要集中在亚基相对角度的变化，而亚基内部的结构在易位过程中基本保持不变。

图4 易位过程中不同局部状态的亚基相对位置示意图

（图源：Jin S, et al., PNAS, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本文通过全新开发的分子动力学力场，利用粗粒化模型模拟出解旋酶在整个易位过程中的动态变化。进一步通过比较ATP、ADP和apo形态的差距以及蛋白质静电力的分析证实了ATP在整个易位过程中起到的驱动作用。在易位的起始阶段，由于ATP所带来的强静电力作用，ATP需要水解并释放才能促进整个反应的发生。而在易位的终末阶段，需要有一个新的ATP分子结合到相应的位点来辅助位于顶端的亚基寻找到稳定的位置。我们还发现这一过程中，解旋酶的环区D2一直与DNA的骨架发生相互作用来保证整个亚基在易位过程中不会脱离DNA的骨架。本文所构建的力场可以应用到其他大型的蛋白质-DNA体系中，感兴趣的读者可以在原文中找到对应的GitHub链接。

原文链接：https://www.pnas.org/doi/abs/10.1073/pnas.2202239119

通讯作者简介（上下滑动阅读） 

高阳于2007年毕业于中国科技大学生命科学系，并于2013年在爱荷华州立大学取得博士学位。经过六年在美国国立健康研究中心的博士后培训，高阳于2019年加入休斯敦莱斯大学任职生命科学系助理教授。高阳实验室的主要研究方向是DNA复制和修复的分子机理。他曾以第一作者或通讯作者身份在Science，Nature Communication, PNAS等杂志发表若干篇论文。

Peter Wolynes教授是国际上著名的物理、化学和生物学家。1976年他23岁就在哈佛大学取得博士学位，后直接留校聘任为助理教授，3年后晋升副教授。随后Wolynes教授先后被聘至伊利诺伊大学厄巴纳香槟分校、加利福尼亚大学圣地亚哥分校、莱斯大学。他于1991年即38岁同时当选为美国文艺和科学学院院士及美国科学院院士，后又当选为哲学学会院士。他已发表论文600余篇,包括在Science，Nature 和PNAS上发表的70多篇论文。在蛋白质折叠和结合动力学、单分子理论和计算方面有重要贡献，尤其是提出了蛋白质结构基础的能量地貌漏斗理论，最近在细胞网络和基因网络方面的基础研究方面又有了新的贡献。

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参考文献

[1] Gao Y, Cui Y, Fox T, Lin S, Wang H, de Val N, Zhou ZH, Yang W. Structures and operating principles of the replisome. Science. 2019; 363(6429):eaav7003. doi: 10.1126/science.aav7003.

本文完