BMC Medicine︱曲春枫团队发现HBV-PreS区变异所致隐匿性HBV感染促发肝细胞癌新机制

撰文︱刘畅，陈坤

责编︱王思珍，方以一

编辑︱方以一

隐匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection，OBI）是指在肝脏和/或外周血中存在有复制能力的HBV DNA，但血清中检测不到乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）[1]。临床上经常有一些慢性肝病患者、部分健康献血者、甚至一些乙肝疫苗接种者存在OBI的报道，许多OBI的发生与感染HBV-PreS变异体有关。该团队前期工作也报道了某些新生儿期接种了乙肝疫苗的成年者存在OBI，这种OBI与HBV-PreS区变异有关[2]，但其临床结局目前还不清楚。既往一项荟萃分析显示，OBI能显著增加肝细胞肝癌（HCC）发病风险[3]。然而，影响OBI进展为HCC的因素及可能的机制目前仍不甚清楚。

随着新生儿乙肝疫苗接种策略的广泛覆盖，及病毒性肝炎患者进行抗病毒治疗方案的应用，HCC的病因学正在发生变迁。因生活方式改变，包括高脂肪膳食结构等因素所致的代谢相关脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated fatty liver disease，MAFLD）正成为HCC发生的重要原因[4]。但目前关于高脂肪膳食是否影响OBI进展为HCC、及其可能作用机制尚不明了。

2022年9月5日，国家癌症中心/中国医学科学院肿瘤医院曲春枫研究员课题组在BMC Medicine上发表了题为“Occult infection with hepatitis B virus PreS variants synergistically promotes hepatocellular carcinoma development in a high-fat diet context by generating abnormal ceramides”的研究，首次发现HBV在PreS区发生变异导致HBsAg氨基酸性质改变后，通过影响HBsAg空间构象使其储留在感染肝细胞内质网，导致神经酰胺从头合成途径代谢异常，高脂饮食加重异常神经酰胺的产生与积聚，如C16:0类神经酰胺，从而活化肝脏浸润的巨噬细胞的NLRP3炎症小体而促发HCC。

基于团队前期工作基础，研究者从236例血清HBsAg阴性、但乙肝核心抗体阳性 [HBsAg(-)&anti-HBc(+)&anti-HCV(-)]及外周血HBV-DNA阳性HCC中，选取35例患者样本进行分析，在其血浆及癌旁肝组织中检测到具有复制活性的HBV-DNA，而在癌组织中，仅在6例(17%)样本中检测到；免疫组化染色发现HBsAg主要在癌旁肝细胞中表达（图1A）。扩增这35例患者的大S区，并与血清HBsAg阳性HCC患者体内分离的HBV序列（Ref-HBV）进行序列比对，发现其在PreS1、PreS2 和S区存在广泛变异，共检测到180个位点的编码氨基酸的变异，变异主要是改变了HBV包膜大蛋白的氨基酸理化性质，即发生了极性和酸碱性转变（图1B）。

图1 血清HBsAg(-)的HCC患者的HBV PreS-S区存在广泛变异

（图源： Liu C, et al., BMC Med, 2022）

采用RaptorX对HBV包膜大蛋白进行空间结构分析，观察到PreS的变异在一定程度上改变了HBsAg的空间构象（图2A）。研究者从中挑选代表发生在PreS1和PreS2的两条变异体的序列，制备了复制型HBV质粒，在转染肝细胞后发现，PreS变异体转染后引起HBsAg储留在内质网（图2B-D）。上述结果表明，PreS区变异导致的氨基酸性质改变会影响HBsAg空间构象，进而抑制HBsAg分泌。 

图2 PreS区变异改变氨基酸性质导致HBsAg储留在肝细胞内质网

（图源： Liu C, et al., BMC Med, 2022）

神经酰胺（ceramides）是鞘脂类化合物的核心分子，其异常分布与积聚是一些代谢相关疾病的重要标志。HBsAg在内质网的储留引发了内质网应激反应，扰乱了内质网的功能（图3A）。肝细胞的内质网既是HBV组装形成完整感染颗粒并分泌的场所，也是ceramides合成的主要细胞器。为此，研究者利用高压液相色谱-串联质谱技术分析了转染细胞内的不同类别ceramides的含量，发现转染HBV质粒，尤其是转染PreS变异体的肝细胞，其细胞中的ceramides含量显著增加，特别是C16:0类ceramide（图3B）。采用棕榈酸处理细胞以模拟脂超载后，细胞内C16：0类ceramide产生增加尤为显著（图3C）。上述结果表明，PreS区变异引起HBsAg在肝细胞内质网中储留，导致ceramides，尤其是C16:0类ceramide产生异常。

图3 PreS区变异导致肝细胞内质网应激，促进ceramides产生

（图源： Liu C, et al., BMC Med, 2022）

Ceramides是一种重要的内源性炎症小体激活物，将无活性的pro-caspase-1转化为caspase-1（p20），使炎性细胞产生的IL-1β及IL-18释放到细胞外，引发下游一系列炎症效应。研究者采用相同浓度的HBV病毒抗原处理炎性巨噬细胞，发现在加入Ceramide后，巨噬细胞分泌大量IL-1β、IL-18（图4A），活化巨噬细胞NLRP3炎症小体（图4B）。进一步采用不同HBV质粒及空载体转染肝细胞，将这些肝细胞上清与炎性巨噬细胞共培养，结果表明，HBV质粒，特别是PreS变异体质粒转染的肝细胞，在相同浓度棕榈酸处理后，其所产生的ceramides能强有力地活化pro-caspase-1，引起巨噬细胞产生并分泌大量IL-1β及IL-18（图4C,D）。上述结果表明，HBV-PreS变异体感染的肝细胞ceramide产生增加，与感染肝细胞产生的HBV抗原协同作用，活化巨噬细胞的NLRP3炎症小体，产生并分泌大量IL-1β及IL-18等细胞因子。

图4 HBV质粒转染的肝细胞所产生的ceramides活化巨噬细胞NLRP3炎症小体

（图源： Liu C, et al., BMC Med, 2022）

既往研究表明，HCC是一种典型的炎症驱动的肿瘤，大量产生的IL-1β及IL-18由此可促发HCC。为此，研究者利用二乙基亚硝胺（DEN）诱导的小鼠原发性肝癌模型，在6周龄时分别尾静脉高压注射前述2株代表性HBV PreS变异体，8周龄开始给予高脂饮食，持续5周（图5A），进一步分析了PreS变异体通过改变肝细胞脂代谢而促发肝脏肿瘤的作用。结果表明：截止小鼠14周龄时，单纯高脂饮食并不能诱发小鼠肝肿瘤，然而，在感染HBV特别PreS变异体后，高脂饮食协同HBV促进小鼠肝脏脂肪变性和炎症细胞的浸润，增加肝组织ceramides的含量，促发小鼠肝脏肿瘤，给予myriocin抑制ceramides从头合成途径，显著降低小鼠肝脏肿瘤负荷（图5B, C）。敲除巨噬细胞的NLRP3后，显著延缓并减少了小鼠肝脏肿瘤的发生（图5D）。上述结果表明，HBsAg空间构象的改变而储留在感染肝细胞内质网，导致神经酰胺从头合成途径代谢异常，高脂饮食加重异常神经酰胺的产生与积聚，从而活化肝脏浸润的巨噬细胞的NLRP3炎症小体而促发HCC。

图5 高脂饮食增强HBV PreS变异体转染小鼠肝组织ceramides产生而促发肝脏肿瘤

（图源： Liu C, et al., BMC Med, 2022）

图6 PreS变异导致隐匿性HBV感染通过促进ceramides产生，活化浸润巨噬细胞NLRP3炎症小体，促发肝细胞癌

（图源： Liu C, et al., BMC Med, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

该研究发现HBV的PreS区变异引起病毒的包膜大蛋白氨基酸性质改变，影响了其空间构象使其储留在感染肝细胞的内质网，使ceramides尤其是C16:0类ceramide产生增加。异常增多的ceramides可能通过激活肝脏浸润巨噬细胞NLRP3炎症小体加重肝脏炎症，促发肝细胞肝癌（HCC），高脂饮食进一步放大了这一作用（图6）。本研究未能确认隐匿性HBV感染（OBI）本身及高脂饮食单独处理对HCC发生发展的影响。

本研究提示OBI个体，至少是由于发生PreS区变异者，可通过调整饮食模式，避免出现代谢综合征，以降低HCC发生风险。此外，乙肝患者在进行有效病毒治疗基础上，靶向降低肝细胞ceramides产生，尤其是C16:0类ceramide产生，或阻断NLRP3炎症小体的活化，有可能延缓HBV感染者向HCC的进展。这还需要前瞻性临床研究进行证实。

原文链接：https://doi.org/10.1186/s12916-022-02481-3 

该研究工作获得中国国家自然科学基金、中国医学科学院医学与健康科技创新工程和北京协和医学院博士研究生创新基金的支持。

第一作者：刘畅（左）、陈坤（中），通讯作者：曲春枫（右）

（照片提供自：曲春枫团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读）

曲春枫，研究员，国家癌症中心/中国医学科学院肿瘤医院免疫学研究室主任，分子肿瘤学国家重点实验室课题组长，博士生导师。研究工作主要围绕宿主对肿瘤发生和生长的免疫反应及肿瘤逃逸免疫控制的机制，由此研发调控机体特异性T细胞功能的免疫学手段。以第一/通讯作者在Journal of Experimental Medicine, PLoS Medicine, BMC Medicine, Gastroenterology, Cellular Molecular Gastroenterology Hepatology, PNAS, Cancer Immunology Research, Journal of Immunology, Cancer Letters, Vaccine 等国内外杂志发表近百篇论著。相关工作被美国、法国、澳大利亚等感染免疫学、胃肠病学专家在包括Nature Reviews of Gastroenterology & Hepatology等杂志进行了推介；被亚太肝癌防控指南及国内相关指南所采纳。以第1完成人的研究成果获“国家教育部科技进步奖”二等奖，“中华预防医学会科学技术奖”二等奖；获多项国家授权发明专利，其中2项已转让到生物公司进行转化。

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Raimondo G, Locarnini S, Pollicino T, Levrero M, Zoulim F, Lok AS. Taormina Workshop on Occult HBVIFM: Update of the statements on biology and clinical impact of occult hepatitis B virus infection. J Hepatol. 2019;71(2):397–408

[2] Wang R, Liu C, Chen T, Wang Y, Fan C, Lu L, et al. Neonatal hepatitis B vaccination protects mature adults from occult virus infection. Hepatol Int. 2021;15(2):328–37.

[3] Shi Y, Wu YH, Wu W, Zhang WJ, Yang J, Chen Z: Association between occult hepatitis B infection and the 533 risk of hepatocellular carcinoma: a meta-analysis. Liver international: official journal of the International 534 Association for the Study of the Liver 2012, 32(2):231-240.

[4] Kulik L, El-Serag HB. Epidemiology and management of hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 2019;156(2):477–491 e471.

本文完