Nat Methods︱陈曦/靳文菲团队开发单细胞多模态组学技术ISSAAC-seq

撰文︱徐   玮

责编︱王思珍，方以一

编辑︱方以一

在同一单细胞中同时检测多个层面的组学信息能更好的揭示细胞间的异质性,帮助我们理解细胞生命活动调控的精细状态。单细胞多组学（single cell multiomics）数据结合拟时序分析能够提供有关组织中细胞类型的关键信息，精细描绘动态过程中的细胞状态。目前，单细胞多组学的技术开发已成为单细胞基因组学领域的前沿热点[1]。已有多种技术能够在同一细胞中同时检测染色质开放性和基因表达，如SNARE-seq [2]、sci-CAR-seq [3] 、Paired-seq [4]、SHARE-seq [5]。但是这些技术由于步骤多、过程繁琐或者数据质量不高、等原因，没有得到广泛使用，仍然有必要开发一个更简洁、更灵敏、能够广泛应用的单细胞多组学技术。

2022年9月15日，南方科技大学生命科学学院陈曦助理教授，靳文菲副教授课题组合作在Nature Methods 上发表了题为“ISSAAC-seq enables sensitive and flexible multimodal profiling of chromatin accessibility and gene expression in single cells”的论文。该研究开发了一种简单可靠的单细胞多模态组学技术ISSAAC-seq（in situ SHERRY after ATAC-seq），能够在同一细胞内，同时检测染色质可及性（ATAC-seq）以及基因表达（RNA-seq）。该方法操作灵活，既适用于基于孔板的低通量实验方案，又可以通过微流控装置进行高通量研究。

ISSAAC-seq的开发基于最近开发的Sequencing HEteRo RNA-DNA-hYbrid (SHERRY) RNA-seq方法[6,7]和陈曦课题组此前发表的scATAC-seq方法[8,9]。实验设计在细胞原位通过两轮差异化的Tn5转座反应，分别标记ATAC-seq和RNA-seq序列,混合扩增建库后测序。实验基本流程为：分离细胞核->开放染色质标记->原位逆转录->原位标记DNA/RNA杂合链->酶切缺口补齐及单链DNA消化->单细胞分选->文库扩增（图1）。由于在RNA原位逆转录时使用了含有TruSeq adapter序列的特异逆转录引物，使得以TruSeq adapter序列为index，可将RNA-seq数据与ATAC-seq数据分离，进行后续数据分析。ISSAAC-seq的关键步骤之一是在30 °C 下进行染色质开放区域标记步骤，而不是 ATAC-seq实验中常用的37 °C。30°C的染色质标记不会影响 ATAC-seq 文库的数据质量，并显著提高了 RNA-seq文库的检测质量。

图1 ISSAAC-seq的实验流程

（图源： Wei Xu et al., Nat Methods, 2022）

这一设计避免了同类方法中的多次细胞混合和分离过程，无需index片段连接，简化了实验流程，提高了建库效率，并得到更高的数据质量。该方法另一大优点是具有灵活的模块化设计，分为原位反应模块以及单细胞分选模块。在单细胞分离之前，一切反应都是在细胞核群体水平完成，这样可以轻松处理大量细胞。随后，研究人员可根据自身课题需要、现有仪器设备等因素，选择合适的单细胞分选的方法。既可以通过孔板进行小规模的测试或者稀有样品的解析，也可以使用微流控装置进行高通量的单细胞测序。对于微流控装置，凡是带有Nextera Read 1序列的平台，ISSAAC-seq均适用。例如10x Genomics Single Cell ATAC[10]，Bio-Rad dscATAC-seq[11]以及HyDrop-ATAC[12]。在文章中，作者测试了基于10x Genomics Single Cell ATAC平台或基于多孔板流式分选平台，结果显示ISSAAC-seq均能在单细胞中测得大于10,000 ATAC unique reads in peaks和2000-5000个基因表达（图2）。其数据质量与10x Genomics Multiome试剂盒相近，远高于已发表的其他开源方法，但成本仅为10x Genomics Multiome试剂盒的一半或更低。

图2 ISSAAC-seq的数据质量示意

（图源： Wei Xu et al., Nat Methods, 2022）

利用这一技术，研究人员分析了来自小鼠大脑皮层的10000多个细胞，鉴定发现了小鼠大脑皮层中主要的和罕见的细胞类型以及细胞类型特异性调控元件，并在由转录组测序结果定义的细胞类群中，进一步分析了染色质开放水平的异质性，揭示了在少突胶质细胞成熟轨迹期间基因表达和染色质可及性的不同动态关系（图3）。

图3 ISSAAC-seq揭示少突胶质细胞成熟轨迹中基因表达和染色质可及性的动态关系

（图源： Wei Xu et al., Nat Methods, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望ISSAAC-seq提供了一种简洁、高质量的多模态组学技术方案。其实验的高度可重复性、模块化设计和低成本的小规模预实验模式也为这一技术在方法学上的进一步拓展提供了可能。借助 ISSAAC-seq 的模块化灵活设计，可以通过使用抗体-寡核苷酸偶联物结合目标蛋白，进一步分析同一细胞中的 ATAC、RNA 和蛋白质信息。一种方案是将带有 UMI 和部分 Nextera Read 1 序列的barcode寡核苷酸连接到抗体上, 直接应用于当前的 ISSAAC-seq 工作流程。由于微流控平台beads上有Nextera Read 1捕捉序列，可以在捕获ATAC-seq、RNA-seq片段的同时捕获目标蛋白的抗体-寡核苷酸信息。另一种更易操作的解决方案是，参照DOGMA-seq[13]的设计思路，合成一种桥接寡核苷酸，连接商业化核酸标记抗体上的寡核苷酸和10x Genomics Single Cell ATAC beads上的Nextera Read 1序列。

这一方法也有一定的局限性，如对起始细胞量有一定的要求，每个样品需达到十万个细胞以上；后续分析流程主要通过RNA-seq数据划分细胞类群和进行拟时序分析，再结合ATAC-seq结果挖掘相应细胞/基因染色质开放性上的差异。在测序技术不断发展的当下，作者也期待有更多分析方法的出现，帮助大家更好地理解多模态组学数据，解析细胞动态。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-022-01601-4

南方科技大学生命科学学院研究助理教授徐玮、高级研究学者杨伟龙为该文共同第一作者、助理教授陈曦、副教授靳文菲为本文的共同通讯作者。此方法也得到了宋昆副教授和洪旎研究助理教授的帮助。博士后陈雅文、博士研究生张云龙等人也参与了该项工作，南方科技大学是论文唯一单位。该研究获得国家重点研发计划、国家自然科学基金、广东省基础与应用基础研究基金、深圳市科技创新委员会、深港脑科学研究所-深圳基础研究院、苏州大学剑桥-苏大基因组资源中心的资助。

通讯作者：陈曦（左）、靳文菲（右）

（照片提供自：陈曦/靳文菲团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读）

陈曦，2009年毕业于北京大学医学部医学实验专业，取得学士学位。后赴英国曼彻斯特大学生命科学系，于2012年取得博士学位。博士期间研究蛋白-DNA结合特异性以及细胞周期G2/M的转录调控。在完成博士研究之后，于2013年加入欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)从事博士后工作，进行功能基因组学、表观遗传学、生物信息学，以及单细胞测序方面的研究。2016年加入维康桑格研究所(Wellcome Sanger Institute)，成为高级研究员，开发单细胞表观遗传测序技术。2019年加入南方科技大学生物系，任助理教授。

靳文菲博士现为南方科技大学生物系副教授/PI ，博士生导师，国家引进海外高层次青年人才，珠江人才计划青年拔尖，深圳市国家级领军人才等。长期从事基因组学、肿瘤免疫、生物信息和精准医学相关研究。发表论文40余篇，其中以第一/通讯作者在Nature、Nat Methods、Mol Cell、Genome Res、 AJHG、Genome Biol 等杂志发表论文19篇，引用>2000次。承担十余项国家和省市级科研项目（其中2项国家重点研发计划课题负责、2项国自然面上主持 ）。担任Front Immunol、Front Med等多个杂志的编委。担任中国生物工程学会系统生物医学专业委员会等多个委员会委员。主要研究方向：1）发展和利用多种单细胞测序技术进行肿瘤微进化研究；2）生物信息学/计算生物学；利用多种组学数据建立疾病风险模型，预测疾病风险和最佳治疗方案，为精准医疗提供指导。曾获南方科技大学“良师益友”优秀研究生导师、致新书院优秀书院导师、NHLBI' Orloff innovation Awards、NIH杰出科研奖（FARE, NIH）、Springer Theses、中科院百篇优博、Eli Lilly Outstanding Thesis、ICHG/ASHG Travel Award等十几种荣誉。

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Zhu, C., Preissl, S. & Ren, B. Single-cell multimodal omics: the power of many. Nat Methods 17, 11–14 (2020).

[2] Chen, S., Lake, B. B. & Zhang, K. High-throughput sequencing of the transcriptome and chromatin accessibility in the same cell. Nat. Biotechnol. 37, 1452–1457 (2019).

[3] Cao, J. et al. Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells. Science 361, eaau0730 (2018).

[4] Zhu, C. et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nat. Struct. Mol. Biol. 26, 1063–1070 (2019).

[5] Ma, S. et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and chromatin. Cell 183, 1103–1116.e20 (2020).

[6] Di, L. et al. RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids. Proc National Acad Sci 117, 2886–2893 (2020).

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[13] Mimitou, E. P. et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nat Biotechnol 1–13 (2021)

本文完