NAR｜王海龙团队发现组蛋白H2AK119位点赖氨酸巴豆酰化到泛素化的动态转换减弱复制压力诱导的转录-复制冲突

撰文︱郝帅林

责编︱方以一，王思珍

编辑︱方以一

基因组DNA受到持续的内源和外源攻击而发生损伤。为应对这些内源及外源的威胁，细胞进化出一整套的DNA损伤应答（DNA damage response，DDR）系统[1,2]。DDR中涉及的细胞网络包括许多蛋白质和蛋白质的翻译后修饰，它们以协调的方式工作以抵消各种基因毒性压力。赖氨酸巴豆酰化修饰（Kcr）是近年来随着质谱技术的发展发现的一种新的酰基化修饰，关于KCr的研究还处于刚开始的阶段，这种新发现的KCr修饰主要会在转录活跃染色质区域，包括启动子上的转录起始位点附近，发现其在转录调控方面有一定的作用。但这种新型的翻译后修饰是否及如何参与其它的生物学过程的调控仍有待进一步的研究。之前的质谱研究中发现H2AK119（H2AK119cr）处存在Kcr[3]，但这种修饰的生物学功能仍不清楚。

2022年9月5日，首都师范大学生命科学学院王海龙教授课题组在Nucleic Acids Research杂志上发表了题为“Dynamic switching of crotonylation to ubiquitination of  H2A at lysine 119 attenuates transcription–replication conflicts caused by replication stress”的研究论文。该研究发现，组蛋白H2A第119位点赖氨酸同时存在巴豆酰化修饰与泛素化修饰（H2AK119cr/ H2AK119ub），均会募集到复制压力下停滞的复制叉，SIRT1对H2AK119的去巴豆酰化是随后通过BMI1泛素化H2AK119的先决条件反转复制叉上H2AK119ub的富集会导致RNA Pol II从DNA模板上移除，在停滞复制叉附近造成转录抑制，进而缓解复制压力诱导的转录与复制冲突。研究揭示了组蛋白H2A位点的巴豆酰化修饰及泛素化修饰在复制压力响应中的重要作用。

作者首先检查了各种DNA损伤诱导剂对H2AK119cr和H2AK119ub整体水平的影响。发现HU、CPT、DOX降低了H2AK119cr的整体水平并增加了三种指定细胞系中的H2AK119ub。同时短期HU或低浓度APH处理会导致复制叉停滞但不会诱导高水平的DSB，也降低了H2AK119cr并增加了H2AK119ub。发现复制压力可以可逆地调节H2AK119cr和H2AK119ub的整体水平的转换（图1）。

图1 DNA 损伤对H2AK119cr和H2AK119ub的调节

（图源：Hao SL, et al., Nucleic Acids Research, 2022）

接下来探究了调控H2AK119cr的去巴豆酰化酶系，发现SIRTS家族的SIRT1负责调控该位点的去巴豆酰化。H2AK119cr在SIRT1-KO细胞中不受HU、CPT或ETOP处理的下调。同时H2AK119ub的水平也没有改变，这表明SIRT1对H2AK119的去巴豆酰化是复制应激期间该位点随后泛素化的先决条件。在BMI1-KO细胞中，HU、CPT或APH诱导的复制应激不再促进H2AK119ub，这表明BMI1在复制应激期间也负责H2AK119ub。然而，HU、CPT和APH处理仍显着降低BMI1-KO细胞中的H2AK119cr水平，表明复制应激诱导的H2AK119去巴豆基化不受BMI1或BMI1介导的H2AK119ub的影响（图2）。

图2 SIRT1在复制压力下促进 H2AK119的去巴豆酰化和随后的泛素化。

（图源：Hao SL, et al., Nucleic Acids Research, 2022）

作者接下来研究了H2AK119ub/H2AK119cr 是否在反向复制叉处积累并帮助细胞减轻复制压力。发现H2AK119ub可以在停滞的复制叉上积累。同时在SIRT1-KO或 BMI1-KO的细胞中没有发现明显的H2AK119ub/EDU PLA病灶，这表明H2AK119ub需要SIRT1介导的去巴豆酰化后BMI1介导的泛素化才能在HU停滞的复制叉上募集。同时在野生型细胞中没有观察到明显的HU诱导的H2AK119cr/EdU PLA信号。在SIRT1-KO细胞中发现了显著的H2AK119cr/EdU PLA信号（图3）。这些发现支持了在没有SIRT1的情况下H2AK119cr在停滞的复制叉上积累的观点。在野生型细胞中，SIRT1在复制压力下从H2AK119中去除巴豆酰化，从而允许在相同的赖氨酸残基上进行其他修饰，例如泛素化。

图3 H2AK119cr/H2AK119ub募集到反转的复制叉。

（图源：Hao SL, et al., Nucleic Acids Research, 2022）

根据前期研究表明H2AK119ub在DSB附近具有抑制转录的功能，作者想知道其募集到反转的复制叉上其功能是否也会与转录相关，是否和R-loop的形成相关。通过实验结果观察到在野生型细胞中HU或DOX处理后R-loop形成增加。SIRT1或BMI1的消耗进一步增加了HU和DOX诱导的R-loop水平。在SIRT1-KO细胞中敲除BMI1或在 BMI1-KO细胞中敲除SIRT1并没有进一步增加HU和DOX诱导的R-loop水平。此外还发现HU处理后野生型细胞中R-loop水平和H2AK119ub之间的相互作用显着增加，其中R-loops和H2AK119ub之间的相互作用明显被RNase H1破坏，表明R-loops和 H2AK119ub之间的关联确实在复制压力下发生（图4）。因此得出结论，SIRT1和 BMI1在复制压力期间以相同的途径运作以协调转录和复制。

图4 在复制压力情况下SIRT1或BMI1的消耗会增加TRC。

（图源：Hao SL, et al., Nucleic Acids Research, 2022）

图5 H2AK119cr/H2AK119ub的具体机制图

（图源：Hao SL, et al., Nucleic Acids Research, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究表明H2AK119cr/H2AK119ub会在复制压力下相互转换，SIRT1负责调控H2AK119cr的去巴豆酰化，并且SIRT1对H2AK119的去巴豆酰化是随后通过BMI1泛素化H2AK119的先决条件。H2AK119cr/H2AK119ub同时可以募集到反转的复制叉上共同作用，解决复制压力引起的TRC。同向转录和复制不是TRC的主要来源，这解释了为什么在未受干扰的细胞中检测到低水平的TRC和相关的R- loop。然而，HU或DOX诱导的停滞的复制叉将在基因组的活跃转录部分诱导dormant origin激活，这降低了与转录同向的复制叉的比例，从而增加了正面碰撞和R- loop形成。由于持续的复制压力，dormant origi激活产生的复制叉将停止、反转和招募SIRT1和BMI1，以去除H2AK119cr并在新生DNA中积累H2AK119ub。被H2AK119ub修饰的染色体可能会阻止RNA Pol II结合，从而导致 RNA Pol II 的释放、转录抑制和TRC减少（图5）。说明SIRT1-/BMI1介导的H2AK119cr到H2AK119ub的动态转换在解决复制应激诱导的TRC中起重要作用。对复制压力下基因组稳定性维持机制的认识具有重要意义。

SIRT1是研究最多的sirtuins，它能够从组蛋白中去除Kac和Kcr，并通过多个底物参与许多生物过程。本工作的一个限制是未能区分SIRT1 是否参与通过去乙酰化或去巴豆酰化活性解决TRC。将来，在SIRT1中鉴定可以将去巴豆酰化活性与去乙酰化活性区分开来的突变体将非常有用。

原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkac734

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Ciccia A., Elledge S.J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 2010; 40:179–204.

[2] Jackson S.P., Bartek J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 2009; 461:1071–1078.

[3] Tan M., Luo H., Lee S., Jin F., Yang J.S., Montellier E., Buchou T., Cheng Z., Rousseaux S., Rajagopal N. et al. . Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 2011; 146:1016–1028.

本文完