Nat Commun | 许超/张凯铭团队等合作揭示Gemin5 羧基端十聚体结合mRNA的机制

撰文︱郭琼

责编︱方以一，王思珍

编辑︱方以一

真核生物mRNA在细胞中运输、翻译以及被RNA结合蛋白（RNA binding proteins，RBPs ）的识别在生物体生长发育中扮演着重要的角色[1]。细胞质存活运动神经元（cytoplasmic survival motor neuron, SMN）复合物介导小核RNA（snRNA）组装成小核核糖核蛋白（snRNP），从而进一步被加工成成熟的mRNA[2]。Gemin 5作为SMN复合物中的RBP与多种神经发育疾病的发生相关，其氮端（G5N）结构域在snRNA的识别和运输中发挥着重要作用[3]，早期文献报道[4]，Gemini 5 蛋白碳端（G5C）在抑制病毒内部核糖体进入位点（IRES）依赖的RNA翻译以及促进自身mRNA的翻译中发挥作用，但G5C结合不同RNA配体并发挥多重调控功能的分子机制仍不清楚。

2022年9月2日，中国科学技术大学许超教授/张凯铭教授团队与西班牙分子生物学中心Encarna Martínez-Salas教授团队合作在Nature Communication上发表了题为“Structural basis for Gemin5 decamer- mediated mRNA binding”的研究。该研究通过G5C近原子分辨率的冷冻电子显微镜结构，并结合体外RNA翻译和结合实验，表明其十聚体的完整结构对于RNA配体的结合及翻译的调控是必不可少的,为相关疾病的治疗提供了分子基础。

文章作者在体外通过纯化得到了同源重组的G5C高分子量的多聚体, 根据文献报道[4]，G5C的RNA结合位点（RBS1）结构域可识别不同的RNA配体，作者在体外分别检测了G5C对手足口疾病IRES元件的D5结构域和Gemin5 自身mRNA的茎环区域（SL1）RNA的结合能力，荧光偏振实验结果表明，G5C对于较长的SL1有更强的结合能力（Kd=6.5±0.7µM)（图1）。

图1  Gemin5结构域以及G5C（Gemin5_841–1508）与SL1、IRES的结合能力检测

（图源： Guo Q, et al. Nat Commum, 2022）

为了探索G5C自组装的分子机制，作者解析了分辨率为3.31A的G5C冷冻电子显微镜结构，发现G5C由32个α螺旋构成，N端α1-α18构成扩展四肽(extended tetratricopeptide ,TPR)结构域，α19-α25构成中间结构域(MID)， C端α26-α32构成五聚体结构域，五个G5C分子（A-E或A’-E’）通过C端区域相关作用形成类似五边形的结构，一个聚体（A-E）分子通过TPR二聚体结构域与另一个五聚体（A’-E’）分子形成同源二聚体，从而组装成G5C同源十聚体结构（图2）。G5C五聚体主要是通广泛的疏水相互作用形成的，大部分参与分子间疏水相互作用的氨基酸在真核生物Gemin5同源蛋白中都是保守的（图2）。

图2 G5C单体三维结构以及单个五聚体分子之间相互作用界面

（图源： Guo Q, et al. Nat Commum, 2022）

为了进一步验证介导疏水相互作用的关键氨基酸残基以及G5C五聚体结构的形成对其RNA结合能力的影响，作者构建了双突变体M1（L1468D/L1469D）和三突变体M2（L1381D/M1384D/I1385D）, 尺寸排除色谱(size-exclusion Chromatography, SEC)实验结果显示，M1和M2均不能形成完整的十聚体结构，EMSA实验结果证实突变体M1和M2对于SL1的结合能力大大减弱，L1469H单突变体仍保持十聚体的构象并具有与野生型相当的SL1的结合能力，这些结果证实了G5C完整的十聚体结构对于RNA配体的结合是必需的（图 3）。

图3 突变体聚合状态及与RNA配体结合强弱检测

（图源： Guo Q, et al. Nat Commum, 2022）

文章作者又进一步探究了影响五聚体稳定性的突变对体内RNA翻译的影响，实验结果表明M1和M2突变体对连接荧光素酶的报告mRNA（luc-SL1和IRES-luc）的翻译效率与野生型相比被抑制了大约1.5-1.8倍，而L1469H单突变体对此并未达到相当程度的抑制，作者推断突变体对蛋白质合成的抑制是由于对RNA结合能力的减弱造成的，因此完整的五聚体/十聚体构象对于Gemin5在细胞内调控mRNA翻译也是必需的（图4）。

图4 报告mRNA（luc-SL1和IRES-luc）的翻译效率检测

（图源： Guo Q, et al. Nat Commum, 2022）

考虑到G5C十聚体对于RNA结合的必要性，作者推测相邻的两个二聚体以协同的方式结合RNA，并检测了RBS1附近的带正电荷的RNA结合区域，发现了一个由B分子TPR结构域和相邻二聚体中的C分子的RBS区域构成的一个大的带正电荷的凹面，将其中的四个碱性氨基酸突变后（M4），仍在SEC实验中呈十聚体状态，但对于RNA的结合能力有所减弱（图5），同时干扰TPR二聚体形成的突变也会极大地减弱对SL1的结合能力。因此，作者提出五聚体的形成对于两个相邻二聚体协同结合RNA配体的茎环结构是十分重要的。已发现的神经发育疾病致病基因突变大都存在五聚体和TPR区域[5]，突变抑制了十聚体完整结构的形成并极大地减弱了Gemin5对mRNA的结合能力。

图5 G5C的RNA结合界面以及M4突变体聚合状态、RNA结合能力检测

（图源： Guo Q, et al. Nat Commum, 2022）

 图6 G5C调控mRNA翻译模式图

 （图源： Guo Q, et al. Nat Commum, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究解析了（Gemini 5 蛋白碳端）G5C仅由α螺旋构成的同源十聚体冷冻电子显微镜高分辨率结构：两个五聚体分子通过TPR二聚体组装成一个紧密的十聚体结构（图6）。五聚体化介导的TPR二聚体的空间排列方式赋予了G5C与有特殊二级结构的RNA配体结合的能力，完整的五聚体/十聚体构象对于G5C结合RNA配体是必不可少的。通过对电镜结构的进一步分析，作者发现了带正电荷的结合RNA配体的凹面，这是由分别来自两个相邻二聚体上的TPR和RBS1结构域构成的，这也解释了G5C更倾向于结合带有较长茎环结构的RNA配体的原因。这个新发现的G5C十聚体结构揭示了Gemin5调控mRNA翻译的分子机制，G5C结合RNA上热力学稳定的茎环结构，形成蛋白核酸复合物，从而保护了mRNA不被降解（图6）。据报道[6]，Gemin5在细胞应激反应期间，被招募到细胞质应激反应颗粒中，这可能与G5C帮助mRNA存储的功能有关（图6）。该研究填补了以往对Gemin5的RNA调控机制认知上的空缺，对相关基因突变导致的神经发育疾病的治疗具有重要意义。但对于全长Gemin5蛋白如何在细胞质应激反应颗粒的形成中发挥作用以及如何调控两端蛋白发挥独立不同功能的，还有待进一步的研究。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-022-32883-z

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Van Nostrand, E. L. et al. A large-scale binding and functional map of human RNA-binding proteins. Nature 583, 711–719 (2020).

[2] Pellizzoni, L., Yong, J. & Dreyfuss, G. Essential role for the SMN complex in the specificity of snRNP assembly. Science 298, 1775–1779 (2002).

[3] Xu, C. et al. Structural insights into Gemin5-guided selection of presnRNAs for snRNP assembly. Genes Dev. 30, 2376–2390 (2016).

[4] Pacheco, A., Lopez de Quinto, S., Ramajo, J., Fernandez, N. &Martinez-Salas, E. A novel role for Gemin5 in mRNA translation. Nucleic Acids Res. 37, 582–590 (2009).

[5] Francisco-Velilla, R. et al. Functional and structural deficiencies of Gemin5 variants associated with neurological disorders. Life Sci. Alliance 5, (2022).

[6] Cauchi, R. J. SMN and Gemins: ‘we are family’… or are we?: insights into the partnership between Gemins and the spinal muscular atrophy disease protein SMN. Bioessays 32, 1077–1089 (2010).

本文完