APS︱韩际宏/陈元利团队揭示LXR激动剂抗肝细胞癌作用的新机制
撰文︱朱猛猛
责编︱王思珍，方以一
编辑︱方以一
肝X受体（liver X receptors，LXRs）是核转录因子超家族的成员，有两种亚型，LXRa和LXRb[1]。LXRa主要在代谢旺盛的组织中表达，如肝脏、脂肪和巨噬细胞，而LXRb在全身普遍表达，这些基因编码的蛋白质在物种间高度一致[2]。LXR激活已被证明在乳腺癌、结直肠癌和其他疾病中具有抗肿瘤作用，这表明LXR在癌症预防和治疗中是一个潜在的靶点[3-5]。肿瘤LXR水平是肝细胞癌患者的预后标志，并显著抑制肝细胞癌的发展[6, 7]。然而，其潜在的机制还需要进一步的研究。
RalA结合蛋白1（RalA binding protein 1，RALBP1）相关的包含EPS结构域蛋白2（EPS domain containing 2，REPS2）在20世纪90年代被发现，该基因编码的蛋白参与生长因子受体的内吞作用[8]，与前列腺癌、乳腺癌、食管鳞癌、结直肠癌等的发生和预后紧密相关[9-11]。然而，REPS2是否参与LXR激动剂T0901317（T317）抗肝细胞癌的作用及其可能的分子机制尚不清楚。
2022年8月22日，合肥工业大学韩际宏教授/陈元利教授团队在Acta Pharmacologica Sinca上发表了题为“Liver X receptor agonists exert antitumor effects against hepatocellular carcinoma via inducing REPS2 expression”的研究。研究人员揭示了REPS2参与了LXR激动剂T317对肝癌细胞增殖和迁移的抑制作用。此外，作者发现T317促进HepG2细胞中REPS2的表达，进而抑制了表皮生长因子介导的EGFR内吞，从而抑制AKT/NF-kB、p38MAPK和ERK1/2等下游信号通路的激活，为肝癌的治疗提供新思路。
肿瘤LXR水平是肝细胞癌患者的预后标志，并显著抑制肝细胞癌的发展[6,7]。临床资料分析显示，REPS2表达水平与肝癌的发生发展呈负相关，REPS2表达降低与预后不良相关，提示REPS2可能参与了肝细胞癌的发生发展。然而，REPS2是否以及如何参与LXR激动剂抗肝细胞癌的作用尚不清楚。
为了检测LXR激活对正常肝细胞以及肝癌细胞REPS2表达的影响，作者首先用梯度浓度的LXR激动剂T317处理，结果表明，T317以浓度依赖的方式诱导2种正常肝细胞（LO2，BNL/CL.2）和2种肝癌细胞（Huh7，HepG2）中REPS2蛋白以及mRNA的表达（图1a, b）。为了确定体内LXR激活与REPS2表达的关系，研究人员给C57BL/6J小鼠（10周龄雌性；n=5）腹腔注射玉米油(对照组)或含有T317的玉米油(5 mg/kg)10 d，实验结束后取小鼠肝脏进行分析，结果显示随着LXRa和LXRb表达的上升，T317显著增加了肝脏中REPS2的蛋白和mRNA的水平（图1c, d）。一致地，免疫荧光染色证实T317诱导LXRa表达和核移位以及REPS2的表达（图1e）。上述结果表明LXR可以在体内体外调控REPS2的表达。
图1 LXR对REPS2的调控作用
（图源：He XY, et al., APS, 2022）
为了检测REPS2是否为LXR的直接靶基因，作者构建了一个REPS2启动子(pREPS2，从−1687到−921)，结果显示T317以浓度依赖的方式诱导LO2细胞中REPS2启动子的活性（图2a）。通过序列比对分析，在REPS2启动子区域发现了一个可能的LXR响应元件（LXR-response element，LXRE），其序列为GGATCAcctgAGGTCA（从−1209到−1193）（图2b），与LXRE的保守序列(AGGTCAn4AGGTCA)非常相似。为了进一步确定这个可能的LXRE在REPS2转录中的重要性，作者在pREPS2的基础上构建了一个带有LXRE突变的REPS2启动子（pREPS2 LXRE突变或pREPS2突变）（图2b）。实验结果表明LXRE突变降低了REPS2启动子的基础活性，T317未能提高pREPS2突变启动子的活性（图2c），说明LXR诱导的REPS2转录依赖于REPS2启动子中LXRE的存在。染色质免疫沉淀分析表明，T317显著增加了LXRa和LXRb蛋白与REPS2启动子中LXRE的结合（图2d）。因此，上述结果表明，LXR通过与REPS2启动子区域的LXRE结合，在转录水平上诱导REPS2的表达。
图2 LXR直接靶向REPS2的转录
（图源：He XY, et al., APS, 2022）
为了研究REPS2与肝细胞癌的关系，作者首先利用TNMplot.com数据库分析了REPS2在肝癌组织中的表达。肝癌组织中REPS2的表达显著低于正常肝组织（图3a）。用Kaplan-Meier数据库分析REPS2表达与肝癌预后关系，发现REPS2低表达患者的10年生存率低于REPS2高表达患者（图3b）。另外，作者收集了肝癌患者的临床样本，免疫组织化学显示，与癌旁肝组织相比，肝癌组织中REPS2和LXRa蛋白的表达显著下调（图3c）。接下来作者研究了REPS2在肝细胞癌中的作用和功能，结果所示，T317显著抑制了HepG2和Huh-7细胞的迁移，而敲低REPS2表达减弱了T317对肝癌细胞迁移和克隆形成能力的抑制（图3d, e）。上述结果表明，LXR至少部分通过上调REPS2的表达来抑制肝癌细胞的增殖和迁移能力。
图3 T317通过诱导REPS2表达抑制肝癌细胞的增殖和迁移
（图源：He XY, et al., APS, 2022）
REPS2被认为参与了表皮生长（epidermal growth factor，EGF）诱导的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）内吞作用，这是EGF诱导细胞增殖和迁移的重要步骤[13, 14]。为了确定LXR是否通过REPS2介导的EGFR内吞作用降低肝癌细胞的增殖和迁移能力，作者评估了在EGF存在的情况下EGFR的内吞作用。EGF刺激EGFR的内吞作用，在EGF处理30min后，超过50%的膜EGFR被内吞，T317处理减少了EGFR的内吞作用，30 min后在膜上的保留率为70%，然而，敲低REPS2表达，T317抑制的内吞作用被恢复（图4a）。上述结果表明，LXR的激活通过上调REPS2的表达减少了EGFR的内吞作用。
图4 T317诱导REPS2表达抑制EGF介导的EGFR的内吞
（图源：He XY, et al., APS, 2022）
EGFR是一种跨膜酪氨酸激酶受体，可被多种配体激活，进而激活促进肿瘤细胞增殖和转移、抑制细胞凋亡的多条信号通路。REPS2被鉴定为RalBP1的结合蛋白，并被认为参与了EGFR信号通路。在HepG2细胞中，EGF处理诱导EGFR的磷酸化表达在大约0.5h达到高峰，然后p-EGFR水平逐渐下降（图5a）。而T317在0.5h时升高p-EGFR水平，此后迅速降低其表达。在0.5h，抑制REPS2的表达对T317诱导的p-EGFR水平增加没有影响，而在1h后，它基本上抑制了T317减少的p-EGFR水平（图5a）。以往的研究表明，EGFR-PI3K-AKT信号轴在肝细胞癌的恶性进展中起重要作用[15, 16]。EGFR-PI3K-AKT通路可通过多种机制进一步激活NF-kB。研究者发现，与对照组相比，T317在0.5 h时诱导AKT的磷酸化水平升高，然后迅速下降，在2h后几乎检测不到（图5b），这表明T317长期治疗抑制了AKT信号通路。相应地，T317在2 h可抑制核因子-kB（nuclear factor-kB，NF-kB）的磷酸化，但敲低REPS2表达可消除T317对p-AKT和p-NF-kB表达模式的影响。进一步的实验表明，PI3K抑制剂LY294002可阻断敲低REPS2对T317诱导的p-AKT和p-NF-kB活性降低的影响（图5c），上述结果表明，T317通过上调REPS2的表达抑制了EGFR-PI3K-AKT-NF-kB信号通路。
p38MAPK和ERK1/2信号通路由受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)或G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors，GPCRs）等细胞表面受体信号转导激活，在肝癌中经常被上调[16]。研究者发现EGF在0.5 h刺激p-ERK1/2上调，2 h依然有较高的表达，而p-ERK1/2在1h后被T317处理降低，2 h后表达几乎消失，相反，在REPS2敲低后，p-ERK1/2逐渐增加（图5d）。p-p38MAPK的表达也有相似的结果。进一步的实验表明，敲低REPS2对T317抑制的p-p38MAPK和p-ERK1/2的影响可被SB203580(p38MAPK抑制剂)和U0126(MEK1/2抑制剂)逆转（图5e）。上述结果表明，T317可以上调REPS2的表达，从而抑制EGFR-MAPK信号通路。
图5 T317诱导REPS2表达降低EGFR介导的信号通路的激活。
（图源：He XY, et al., APS, 2022）
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35995867/
第一作者：贺晓雨（左一）、朱猛猛（左二）， 通讯作者：韩际宏（右二）、陈元利（右一）
（照片提供自：韩际宏/陈元利团队）
通讯作者简介（上下滑动阅读）
陈元利：合肥工业大学副教授，药物科学与工程系副系主任，合肥工业大学SPF级动物实验中心主任，重大疾病代谢及营养调控安徽普通高校重点实验室主任韩际宏教授研究团队学术骨干。主要从事慢性重大疾病病理和药理机制研究，作为通讯/第一作者在J Hepatol、Brit J Pharmacol、ATVB等期刊发表高水平研究论文27篇，相关研究成果累计被引用1200余次。完成国家自然科学基金项目面上项目1项、青年科学基金项目1项。作为核心骨干获得教育部高等学校科学研究优秀成果奖（科学技术）自然科学奖二等奖、中华医学会医学科学技术奖三等奖。
韩际宏：长江学者特聘教授，973计划首席科学家，合肥工业大学食品与生物工程学院教授、博士生导师，国家自然科学基金会评专家，科技部、卫计委国家重点研发计划评审专家，科技部国际合作项目、国家重大研究计划评审专家，国家科技奖励评审专家，中国生物化学与分子生物学会脂质与脂蛋白专业委员会常务委员。近年来主持973计划、科技部国际合作重点项目、国家自然科学基金等项目十余项。目前已在国际一流刊物上以通讯作者等身份发表90多篇论文并多次在国际学术大会作报告，总科学影响因子高于400点，被引用次数总计3000次以上，研究成果曾获教育部2018年高等学校科学研究优秀成果自然科学二等奖和中华医学会2019年科学技术三等奖。【1】Nat Methods︱张阳团队发布蛋白质、核酸及其复合物的通用结构比对算法：US-align
【2】BMC Medicine︱宋欢/索晨团队发现精神疾病遗传易感性与COVID-19感染风险相关
【3】STTT 综述︱蔡春梅/郑春福评述环指蛋白家族（RNFs）在健康和疾病中的研究进展
【4】Redox Biol︱吴希美/邹朝春团队合作发现维生素C缺乏导致幼雌鼠发生低血糖并揭示其中相关分子机制
【5】PNAS︱李刚课题组绘制婴幼儿大脑皮层表面积发育模式和区域化图谱
【6】Sci Adv︱姚军课题组构建三维纳米晶体管用于同时监测心肌细胞的生物电和机械信号
【7】Sci Adv︱赵存友/陈荣清团队揭示微小RNA诱导小鼠出现社交和记忆异常机制：miR-501-3p表达缺陷增强谷氨酸能传递
【8】Acta Neuropathol︱翻转酶ATP11B异质表达缺失导致脑小血管疾病
参考文献（上下滑动阅读）
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本文完