J Cell Biochem︱陈柳莹/侯晓华/杨玲团队发现HSP90抑制剂阻止胆管细胞坏死性凋亡减轻原发性胆汁性胆管炎

撰文︱陈柳莹，杨玲

责编︱方以一，王思珍

编辑︱方以一

原发性胆汁淤积性胆管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一种以肝内胆管损伤、胆汁淤积和进行性肝纤维化为特征的自身免疫性肝病。在遗传、环境因素的作用下，黏膜免疫失调和胆道碳酸氢盐屏障缺陷，导致患者出现胆管损伤[1]。对PBC患者胆管损伤机制的研究有利于新药的开发。

坏死性凋亡（necroptosis）是一种程序性坏死细胞凋亡。尽管坏死过程是可控的，但与细胞凋亡不同，细胞坏死释放的细胞内成份可以触发免疫反应。在梗阻性胆汁淤积小鼠模型和PBC患者肝组织中均发现necroptosis激活[2, 3]。但是，PBC患者胆管上皮细胞发生坏死性凋亡的机制还不甚清楚，抑制胆管上皮细胞的细胞程序性死亡可能是PBC的一个潜在治疗靶点。

2022年8月，华中科技大学同济医学院附属协和医院杨玲/侯晓华教授团队在Journal of Cellular Biochemistry杂志发表了题为“The HSP90 inhibitor 17‐DMAG alleviates primary biliary cholangitis via cholangiocyte necroptosis prevention”的研究。该研究探讨了HSP90在胆管细胞坏死凋亡中的作用和潜在的治疗策略。研究表明HSP90抑制剂17-DMAG可阻止胆管细胞坏死性凋亡减轻原发性胆汁性胆管炎。

HSP90是热休克蛋白家族中重要的一员，是一种调节多种蛋白结构和功能的分子伴侣。HSP90在机体的抗感染免疫、肿瘤免疫及自身免疫反应中发挥重要的作用。在坏死性凋亡过程中，HSP90可以保护三个关键的坏死性凋亡效应蛋白(RIPK1、RIPK3和MLKL)免受蛋白酶体降解[4]。 研究表明HSP90对细胞坏死性凋亡中MLKL的稳定及膜易位是必需的[5, 6]。 HSP90在胆管细胞坏死中的作用尚未被研究。17- dimethylaminoethylamino (17-DMAG) 作为一种HSP90抑制剂，已广泛应用于癌症和炎症性疾病的治疗[7]。 本主要研究探讨17-DMAG对抵抗PBC胆管细胞的坏死性凋亡的作用。

研究者首先发现与对照组相比，HSP90在PBC患者的胆管细胞中高表达，并伴随着p-MLKL、RIPK3、MLKL和RIPK1表达的升高（图1A）。RT-PCR提示HSP90AB1和HSP90B1在PBC患者肝组织表达也增加（图1B)。然后，作者进一步探讨HSP90在PBC小鼠模型中的作用。通过2OA - BSA免疫和poly I:C处理建立PBC小鼠模型。PBC小鼠出现汇管区免疫细胞浸润（图1C），特别是小叶内胆管周围。同时PBC小鼠血清中抗PDC‐E2水平升高（图1D）。与对照组相比，IHC检测到PBC小鼠肝内胆管细胞HSP90、RIPK3、MLKL、p-MLKL和RIPK1的表达明显增加(图1E）。PBC小鼠肝组织HSP90AA1、HSP90AB1、HSP90B1、RIPK3、MLKL和RIPK1的mRNA表达也升高（图1F）。这些结果提示PBC肝内胆管上皮细胞出现坏死性凋亡。

图1  PBC患者和小鼠肝内胆管细胞坏死性凋亡伴随HSP90表达增高。

（图源：Chen L, et al., J Cell Biochem, 2022）

与未接受17-DMAG治疗的PBC小鼠相比，17-DMAG治疗的PBC小鼠胆管炎症减轻（图2A）。同时，血清抗PDC-E2、ALP和TB水平均下降（图2B-D）。17-DMAG处理后PBC小鼠血清中IL-6、IFN-γ和TNF-α水平下降（图2E），肝脏组织中IL-6、IFN-γ、MCP-1和TNF-α mRNA表达水平也降低（图2F）。但是，IL-1表达没有显著差异。与未经17-DMAG处理的PBC小鼠相比，17-DMAG处理后PBC小鼠肝内胆管上皮细胞HSP90、MLKL、RIPK3和RIPK1表达明显降低（图3A）。PBC小鼠肝脏坏死性凋亡蛋白RIPK1、MLKL、p-MLKL、RIPK3、p-RIPK3和HSP90表达水平高于对照组（图3B），17-DMAG干预后表达下降（图3B）。以上结果表明HSP90抑制剂17-DMAG可以抑制胆管上皮细胞的坏死性凋亡，可能是一种潜在的治疗PBC的药物。

图2  17-DMAG干预改善PBC小鼠的肝炎症损伤。

（图源：Chen L, et al., J Cell Biochem, 2022）

图3 17-DMAG干预减轻PBC小鼠肝内胆管上皮细胞坏死性凋亡。

（图源：Chen L, et al., J Cell Biochem, 2022）

为了进一步揭示HSP90在胆管上皮细胞坏死性凋亡中的作用机制，研究者进行了免疫共沉淀实验，并采用HPLC-MS分析与HSP90作用的蛋白。分析后发现RIPK1与HSP90结合。17-DMAG处理的人源肝内胆道上皮细胞24h后，RIPK1蛋白水平明显下降（图4A）。并且， 17-DMAG处理引起的RIPK1表达下降可以通过蛋白酶体抑制剂MG132来纠正（图4B）。RIPK1的正常半衰期约为25.2 h，经17-DMAG处理后，半衰期缩短至17.0h（图4C）。17-DMAG处理增强了HSP90 siRNA对RIPK1表达的抑制（图4D）。这些结果表明，HSP90与RIPK1的结合对RIPK1的稳定至关重要。17-DMAG诱导RIKP1与HSP90分离，加速了蛋白酶体对RIPK1的降解。

图4  17-DMAG通过加速RIPK1降解缓解胆管细胞坏死性凋亡。

（图源：Chen L, et al., J Cell Biochem, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望综上，作者发现原发性胆汁淤积性胆管炎（PBC）患者胆管上皮细胞存在坏死性凋亡。HSP90高表达通过稳定RIPK1，阻止RIPK1被蛋白酶体降解介导了胆管细胞的坏死性凋亡。17-DMAG可加速RIPK1的降解，缓解胆管细胞的坏死性凋亡，可能是治疗PBC的一种潜在方法。但是，通过腹腔注射17-DMAG抑制肝脏HSP90的方法缺乏特异性，尽管约50%的17-DMAG是由胆汁排泄。未来通过体内干预HSP90表达，将更能阐明其在胆管上皮细胞损伤中的作用，拓展我们目前对PBC的认识。总之，目前针对PBC的治疗手段十分有限，深入了解胆管细胞死亡的分子机制将为PBC患者带来新的治疗手段。

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36037317/

华中科技大学同济医学院附属协和医院杨玲教授、侯晓华教授为共同通讯作者。华中科技大学同济医学院附属协和医院陈柳莹博士后、范慧倩博士为共同第一作者。本研究受到了国家自然科学基金委及武汉市科技厅的基金支持。

通讯作者：杨玲（左）、侯晓华（右）

（照片提供自：杨玲/侯晓华团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读） 

杨玲，主任医师, 博士生导师。中国老年医学会消化病学分会常务委员，中华医学会消化病学分会肝胆学组委员，中华医学会消化病学分会微生态协作组委员，中华医学会消化病学分会中西医结合协作组委员。主持国家自然科学基金5项，省重大专项1项，在Gastroenterology、Hepatology、J Clinical Investigation、J Hepatology、Cancer Lett等国际、国内期刊发表论著共40余篇，被Nature、Cell、Hepatology、Cell Metabolism等杂志广泛引用。

侯晓华，主任医师，教授，博士生导师。现任亚洲神经胃肠病和动力学协会常务理事，国际胃肠电生理学会委员，中国医师协会消化医师分会副会长，中国生理学会消化与营养专业委员会副主任委员。在肠道炎症性疾病、神经胃肠疾病与动力领域主持国家自然科学基金10项(包括重点项目1项、国际合作项目1项)、卫生部重点项目2项，承担国家重大医疗仪器专项1项、科技部支撑计划项目2项。作为第一/通讯作者共发表SCI文章257篇，他引5517次，H因子42；主编著作10部，参编教材等20余部。

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Gulamhusein, A.F. and G.M. Hirschfield, Primary biliary cholangitis: pathogenesis and therapeutic opportunities. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2019. 17(2): p. 93-110.

[2] Afons, M.B., et al., Activation of necroptosis in human and experimental cholestasis. Cell Death Dis, 2016. 7(9): p. e2390.

[3] Afonso, M.B., et al., miRNA-21 ablation protects against liver injury and necroptosis in cholestasis. Cell death and differentiation, 2018. 25(5): p. 857-872.

[4] Jacobsen, A.V. and J. Silke, The importance of being chaperoned: HSP90 and necroptosis. Cell chemical biology, 2016. 23(2): p. 205-207.

[5] Zhao, X.M., et al., Hsp90 modulates the stability of MLKL and is required for TNF-induced necroptosis. Cell death & disease, 2016. 7: p. e2089.

[6] Jacobsen, A.V., et al., HSP90 activity is required for MLKL oligomerisation and membrane translocation and the induction of necroptotic cell death. Cell death & disease, 2016. 7: p. e2051.

[7] Mellatyar, H., et al., Targeted cancer therapy through 17-DMAG as an Hsp90 inhibitor: Overview and current state of the art. Biomedicine & pharmacotherapy = Biomedecine & pharmacotherapie, 2018. 102: p. 608-617.

本文完