Small Methods︱来自鲨鱼的纳米抗体可有效中和多个新冠变异株

来源︱“ 赛业生物订阅号”

编辑︱方以一

自2019年12月首次发现以来，新冠肺炎（COVID-19）目前已造成全球5.8亿人感染，超过600万人死亡。尽管疫苗和药物在不断上市，但Delta和Omicron等多个变异株的出现给疾病的预防和治疗带来了相当大的挑战，因此迫切需要更多且有效的预防和治疗策略。

广谱性中和抗体的开发是一种有希望应对目前新冠大流行的策略之一。近年来，来自骆驼等动物的单域抗体受到了广泛关注。单域抗体指仅含有重链可变区的抗体片段，其分子量（15kD）远远小于人类抗体（150kD），通常被称为纳米抗体。该抗体不仅具有亲和力高、热稳定性好、生产成本低等特点，还能与传统抗体无法接触的表位结合。

近日，广州医科大学呼吸疾病国家重点实验室、广州实验室、中科院广州生物医药与健康研究院、厦门联合呼吸健康研究院等多个机构的研究人员在Small Methods杂志上发表了题为“A Class of Shark-Derived Single-Domain Antibodies can Broadly Neutralize SARS-Related Coronaviruses and the Structural Basis of Neutralization and Omicron Escape”的研究论文。研究人员从鲨鱼中筛选出一种单域抗体，能够有效中和新冠病毒的多个变异株，为预防和治疗COVID-19提供了新的选择。

一、研究材料和方法

研究主要使用了鲨鱼、293T、VeroE6细胞，C57BL/6背景的hACE2转基因小鼠（由赛业生物提供）、Balb/c小鼠等。

研究人员主要使用了细胞转染、噬菌体文库构建、ELISA、WB等实验技术。

二、技术路线

1、通过免疫鲨鱼筛选出抗新冠病毒的纳米抗体

2、ELISA评估纳米抗体中和SARS-CoV-2变异株的能力

3、分析纳米抗体在hACE2小鼠的预防和保护作用

4、晶体结构解析纳米抗体与病毒的结合位点

5、探索Omicron变异株免疫逃逸的机制

三、研究结果

1、20G6和17F6纳米抗体可广泛中和SARS-CoV-2变异株

之前的研究发现，来自骆驼的单域抗体能够与SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合区域（Receptor Binding Domain, RBD）结合。鲨鱼的免疫系统也会产生一种单域抗体，即可变的新抗原受体（Variable New Antigen Receptor, VNAR），大小相当于人类抗体的十分之一。于是，研究人员以人工饲养的条纹斑竹鲨作为研究对象，用SARS-CoV-2刺突蛋白对鲨鱼进行免疫接种，并构建了噬菌体展示文库。

经过三轮生物淘选，他们获得了26个与武汉病毒株的RBD区域特异结合的纳米抗体。其中，纳米抗体20G6和17F6的RBD结合活性最高。后续分析表明，这两种纳米抗体还能与SARS-CoV-2的Alpha、Beta、Kappa、Delta等变异株的RBD结合，亲和力在皮摩尔级别。因此，20G6和17F6对多个值得关注变异株的RBD具有广泛的反应性。

之后，研究人员利用假病毒中和测定法来评估20G6和17F6对SARS-CoV-2武汉毒株及多个变异株的中和能力，发现20G6和17F6单体和二聚体都可以中和SARS-CoV-2变异株，其半数最大抑制浓度在纳摩尔范围。病灶减少中和实验的结果也表明，单价和二价形式的20G6和17F6纳米抗体可以中和SARS-CoV-2变异株。

2、20G6纳米抗体对接种新冠病毒的小鼠具有预防和治疗作用

研究人员接着评估纳米抗体在新冠病毒感染hACE2小鼠过程中是否具有预防和治疗作用。他们在小鼠的鼻腔内滴入20G6纳米抗体，然后用武汉毒株或Beta变异株感染小鼠。与对照组相比，预防组小鼠体内病毒基因组RNA拷贝数下降。另外，他们用武汉毒株或Beta变异株感染小鼠后，通过腹膜注射或鼻内滴注的方式给予20G6-Fc，发现治疗组小鼠体内病毒基因组RNA的拷贝数也下降（图1），此外，预防组和治疗组小鼠体重均未显著下降，而且肺病理学特征显著减少。这些结果表明，20G6纳米抗体能够在预防和治疗模型中有效保护小鼠免受SARS-CoV-2武汉毒株和Beta变异株感染。

图1 20G6纳米抗体对SARS-CoV-2感染的预防和治疗效果

（图源：Bo Feng, et al., Small Methods, 2022）

3、纳米抗体通过WXGY基序与RBD结合

为了探索这两种纳米抗体有效中和病毒的结合位点，研究人员从结构生物学的角度继续开展研究。他们发现，20G6和17F6在CDR3中都包含一个独特的“WXGY基序”，作为纳米抗体与RBD相互作用的中心（图2）。这个基序通过β-折叠与RBD上的隐藏表位（365-380）结合，而该表位在β-冠状病毒中是高度保守的，表明这两种抗体具有广泛的中和活性。

有趣的是，他们发现20G6和17F6纳米抗体能够有效中和穿山甲冠状病毒和蝙蝠冠状病毒，却不能中和Omicron和SARS-CoV-1病毒，那么Omicron变异株如何实现免疫逃逸？他们通过突变分析发现，Omicron RBD上的S375F突变可破坏RBD的β-链结构，从而削弱抗体与抗原的相互作用，使得Omicron变异株和SARS-CoV-1逃逸纳米抗体中和。

图2 20G6纳米抗体结合并中和β-冠状病毒的能力

（图源：Bo Feng, et al., Small Methods, 2022）

总结

本研究从鲨鱼体内筛选出两个纳米抗体，通过鼻腔给药可预防大多数SARS-CoV-2变异株的感染。纳米抗体通过WXGY基序与RBD结合，具有广谱结合能力，但Omicron变异株除外，S375F突变是Omicron变异株逃逸抗体中和的主要突变点。该研究为新冠病毒逃逸机制的研究及疫苗抗体的开发提供思路。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smtd.202200387

往期文章精选优质科研培训课程推荐【1】R语言临床预测生物医学统计专题培训（10月15-16日，北京·中科院遗传与发育生物学研究所）欢迎加入“岚翰生命科学”
本文完