APS︱杨德华/王明伟团队高通量筛选发现新型PFKFB3小分子抑制剂

撰文︱李  洁

责编︱王思珍，方以一

编辑︱杨彬薇

血管生成（“Angiogenesis”）会促进多种疾病的发生发展，例如肿瘤[1]。诱导血管生成是肿瘤的十大特征之一，为满足对营养物质的高需求，肿瘤组织中血管丰富[2-5]。目前已经开发出抗血管生成疗法来“饿死”癌细胞，该策略靶向促血管生成信号如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），但具有耐药性、疗效不足和毒副作用等缺点[6]。因此，开发具有不同作用机制的替代性抗血管生成药物至关重要，例如通过干扰血管生成中的内皮细胞代谢过程。

改变内皮细胞的代谢活性可以影响血管生成，阻断这些代谢途径中的关键酶可以抑制眼部和炎症性疾病中的血管生成，且不会引起全身毒性[4,7-9]。磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3（Phosphofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase 3，PFKFB3）通过其激酶活性的产物（果糖-2/6-二磷酸）正向调节糖酵解，该过程是内皮细胞的主要能量来源[4]，因此，抑制PFKFB3活性可以抑制病理性血管生成，使原本异常的肿瘤血管正常化，且没有毒性[9]。因此，抑制内皮细胞代谢进而抑制血管生成的途径将开创抗肿瘤血管生成疗法的崭新局面。但目前临床上还没有可以高效且特异性地抑制PFKFB3激酶活性的口服小分子药物，现有的PFKFB3抑制剂如3PO[10]及其衍生物PFK015 [11]和PFK158[11]本质上都只是工具化合物，虽然它们的抑制效果很好，但其抑制作用可能基于高活性的羰基基团的共价连接，特异性较差且化学结构单一。因此开发新的PFKFB3小分子抑制剂将为抗血管生成药物的研发提供更多的可能性。

2022年9月16日，中国科学院上海药物研究所杨德华团队携手复旦大学基础医学院王明伟团队在Acta Pharmacological Sinica（APS）上发表了题为“A high-throughput screening campaign against PFKFB3 identified potential inhibitors with novel scaffolds”的研究文章。该研究对超过25万个化合物开展高通量筛选、后续功能验证和计算分析，得到了3个结构新颖的活性化合物，为开发新的PFKFB3抑制剂提供了新的探索方向。（拓展阅读：王明伟/杨德华团队最新研究成果，详见“岚翰生命科学”报道（点击阅读）：PNAS︱王明伟/Vogt/杨德华/水雯箐团队深度解析重要药物靶标磷脂酰肌醇3激酶α的结构与功能）

为了发现PFKFB3的潜在抑制剂，作者建立了基于PFKFB3体外激酶活性的稳定高通量筛选模型，对国家化合物样品库内的250,240个化合物进行高通量筛选，得到了507个在20 μM下PFKFB3激酶活性抑制率大于50%的化合物（图1）。为排除初筛中的假阳性，研究者对这507个化合物进行了复筛验证和剂量依赖性检验，得到66个半抑制浓度（IC₅₀）低于10 μM的活性化合物。通过对代表性化合物母核结构的相似性检索，得到了一个IC₅₀=1.53 μM的相似化合物WNN3133-A003，这进一步表明了该高通量筛选模型的可靠性。

图1  高通量筛选中的阳性对照Compound 67结构式、高通量筛选模型建立和初筛结果。

（图源：Jie Li, et al., APS, 2022）

此外，作者还采用基于表面等离子共振（Surface plasmon resonance，SPR）的Biacore技术验证活性化合物与PFKFB3蛋白间的直接相互作用，并用原代人脐静脉内皮细胞（Primary human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）开展成管实验验证化合物的血管生成抑制能力。作者发现了22个没有毒性且能显著抑制HUVEC成管的化合物，其中15个化合物能与PFKFB3结合，它们都不含有羰基结构，这表明其作用机制与已报道的化合物不同。为排除可能非特异性的假阳性化合物，研究团队使用三种分析工具（Badapple混杂预测器、聚集物分析器和泛筛选干扰化合物（Pan-assay interference compounds，PAINS）筛选器进行计算分析，最终得到了3个（图2）在上述三种计算分析方法中都没有PAINS警报的化合物，表明它们的成药性可能性较强。研究人员进一步通过分子对接探索了这些化合物的潜在结合位点，发现这3个化合物可能通过占据底物结合位点来抑制PFKFB3激酶活性（图3）。

图2 三个活性化合物显示出与PFKFB3的结合亲和力，并表现出成管抑制能力。

（图源：Jie Li, et al., APS, 2022）

图3  三个活性化合物与PFKFB3的相互作用模式分析。

（图源：Jie Li, et al., APS, 2022）

此外，作者还通过细胞热迁移实验（Cellular thermal shift assay，CETSA）、乳酸分泌实验和葡萄糖摄取实验在高表达PFKFB3的A549细胞中证明了它们具有与PFKFB3的靶标结合能力，并且在不同程度上抑制糖酵解通量。在这三个化合物中，WNN1542-F004抑制A549细胞的乳酸分泌和葡萄糖摄取最为显著。这些化合物的糖酵解抑制作用值得后续深入研究。

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究通过基于PFKFB3体外激酶活性的高通量药物筛选、剂量依赖性检验和相似化合物检索，得到67个半抑制浓度（IC₅₀）低于10 μM的化合物，后续的体外功能实验和亲和力检测确证了15个能显著（P<0.05）抑制HUVEC成管，且与PFKFB3蛋白有结合的化合物，其中3个通过了PAINS分析，且分子对接研究表明其可能通过占据PFKFB3的底物结合位点发挥抑制作用。这项研究为开发靶向PFKFB3的新型抗血管生成药物提供了依据和思路。为进一步确证活性化合物的生物学功能，后续的体内功能验证也必不可少。此外，针对这些活性化合物的母核结构，可以通过构效关系改造和实验验证，得到活性更高、特异性更好、毒副作用更小的PFKFB3抑制剂。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41401-022-00989-1

中国科学院上海药物研究所杨德华研究员和复旦大学基础医学院王明伟教授是该论文的共同通讯作者，复旦大学基础医学院博士研究生李洁为第一作者，参与本研究的还有中国科学院上海药物研究所周燕助理研究员、复旦大学基础医学院周庆同青年研究员、复旦大学附属浦东医院药剂科陆惠平主任和马芬芬药师等。该研究获得了比利时鲁汶大学—VIB研究所Peter Carmeliet教授实验室的支持。

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Carmeliet P, Jain RK. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 2011;473:298–307.

[2] Krutzfeldt A, Spahr R, Mertens S, Siegmund B, Piper HM. Metabolism of exogenous substrates by coronary endothelial cells in culture. J Mol Cell Cardiol. 1990;22:1393–404.

[3] Culic O, Gruwel ML, Schrader J. Energy turnover of vascular endothelial cells. Am J Physiol. 1997;273:C205–13.

[4] De Bock K, Georgiadou M, Schoors S, Kuchnio A, Wong BW, Cantelmo AR, et al. Role of PFKFB3-driven glycolysis in vessel sprouting. Cell. 2013;154:651–63.

[5] Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011;144:646–74.

[6] Jayson GC, Kerbel R, Ellis LM, Harris AL. Antiangiogenic therapy in oncology: current status and future directions. Lancet. 2016;388:518–29.

[7] Ghesquiere B, Wong BW, Kuchnio A, Carmeliet P. Metabolism of stromal and immune cells in health and disease. Nature. 2014;511:167–76.

[8] Schoors S, De Bock K, Cantelmo AR, Georgiadou M, Ghesquiere B, Cauwenberghs S, et al. Partial and transient reduction of glycolysis by PFKFB3 blockade reduces pathological angiogenesis. Cell Metab. 2014;19:37–48.

[9] Schoors S, Cantelmo AR, Georgiadou M, Stapor P, Wang X, Quaegebeur A, et al. Incomplete and transitory decrease of glycolysis: a new paradigm for antiangiogenic therapy? Cell Cycle. 2014;13:16–22.

[10] Clem B, Telang S, Clem A, et al. Small-molecule inhibition of 6-phosphofructo-2-kinase activity suppresses glycolytic flux and tumor growth. Mol Cancer Ther: 2008, 7: 110-20.

[11] Clem BF, O'Neal J, Tapolsky G, et al. Targeting 6-phosphofructo-2-kinase (PFKFB3) as a therapeutic strategy against cancer. Mol Cancer Ther: 2013, 12: 1461-70.

本文完