Cell Death Dis︱李林海/肖斌/孙朝晖团队发现锌指蛋白ZNF276在乳腺癌中的分子机制

撰文︱雷婷，肖斌

责编︱方以一，王思珍

编辑︱方以一

自2020年起，乳腺癌（Breast cancer）已取代肺癌成为最常见的恶性肿瘤[1]。转移仍然是乳腺癌相关死亡的主要原因。由于目前复杂的乳腺癌转移机制尚未阐明，多种转移驱动基因难以成为药物靶点，急需探索新的靶点和相关机制。

锌指蛋白（Zinc finger proteins，ZNFs）是真核细胞中最大的转录因子家族，许多ZNFs参与了乳腺癌细胞的关键生物学过程，如增殖、凋亡、转移、耐药、自噬和干细胞特性等[2-4]。锌指蛋白276（Zinc finger protein 276，ZNF276）是ZNF家族的成员之一，其在各种恶性肿瘤中的生物效应在很大程度上是未知的。ZNF276的编码基因位于染色体16q23.4，在乳腺肿瘤中常发生杂合性缺失[5]。对ZNF276编码区进行突变分析表明，ZNF276可能是一种肿瘤抑制因子，但目前尚未有确切证据揭示它在乳腺癌中的作用。

细胞色素P450 1B1（Cytochrome P450 1B1，CYP1B1）是一种单氧酶，在脑、乳腺和结肠肿瘤[6]等多种肿瘤中高度表达，这使研究者对CYP1B1在肿瘤发生中的作用产生强烈兴趣。已有研究表明，CYP1B1的过表达与通过促炎症细胞因子、转移以及细胞增殖、迁移和分化的调节紊乱而增加的癌症风险有关[7,8]。此外，CYP1B1的过表达促进肿瘤大小增加、等级增高以及淋巴结转移和淋巴管侵袭[9]。尽管CYP1B1的表达与Wnt/β-catenin通路的激活显著相关[10]，但CYP1B1的表达调控机制仍不清楚。

黑色素瘤相关抗原B2（Melanoma-associated antigen B2，MAGEB2）属于黑色素瘤抗原基因（MAGE-I）家族的肿瘤特异性抗原，与头颈部鳞状细胞癌、喉癌和神经鞘瘤[11-13]等多种肿瘤疾病相关。MAGEB2可通过MAGE同源结构域中的F-box与AR的NH2末端NTD结构域结合，并通过上调其下游靶点PSA和NX3.1来激活AR信号，促进前列腺癌细胞生长[14]。MAGEB2已被证明能促进核糖体rRNA和转录因子E2F的转录，但MAGEB2如何形成转录复合物来共同调节下游基因表达的机制尚未清晰。

近日，广州医科大学附属第六医院（清远市人民医院）李林海/肖斌教授、中国人民解放军南部战区总医院孙朝晖教授课题组合作在Cell Death & Disease上发表了题为“ZNF276 promotes the malignant phenotype of breast carcinoma by activating the CYP1B1-mediated Wnt/β-catenin pathway”的研究。研究发现，在乳腺癌组织和细胞中ZNF276的表达上调，且高表达ZNF276提示乳腺癌患者的预后较差。ZNF276招募MAGEB2并占据CYP1B1启动子位点，上调CYP1B1的转录水平并激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移和转移等进程。该研究以ZNF276为切入点，初步揭示了锌指蛋白在乳腺癌发生发展中介导细胞增殖和转移的关键作用和机制。雷婷、张文武、何咏茵、魏奭为本文的共同第一作者。

这项研究首先检测了ZNF276的mRNA和蛋白在乳腺癌组织和细胞中的表达并对ZNF276的预后诊断价值进行评估（图1）。结果显示，ZNF276在乳腺癌组织和细胞中均表达上调，ZNF276的表达与乳腺癌患者年龄、WHO分级、TNM分级、临床分期等临床特征呈正相关，高表达ZNF276的乳腺癌患者总生存率较低，提示ZNF276蛋白表达与乳腺癌发生发展密切相关。

图1 ZNF276在乳腺癌组织和细胞系中的表达及预后

（图源：Lei T，et al., Cell Death Dis, 2022）

为进一步明确ZNF276的作用，作者根据ZNF276在6种乳腺癌细胞的内源性表达情况，构建了ZNF276过表达、敲低和敲除细胞，并通过CCK8、Transwell、克隆形成实验等一系列表型实验检测ZNF276对乳腺癌增殖、侵袭和迁移的影响。结果显示，过表达ZNF276使得MDA-MB-231和SK-BR-3细胞的增殖、侵袭和迁移能力显著增强，而在MCF-7敲低和在UACC-812中敲除ZNF276后，这两种细胞的增殖、侵袭和迁移能力受到抑制（图2）。

图2 ZNF276促进乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移

（图源：Lei T，et al., Cell Death Dis, 2022）

为进一步探究ZNF276对乳腺癌瘤体生长和转移的影响，作者将ZNF276稳转株或对照株皮下注射至BALB/c裸鼠以建立异种移植模型，发现实验组小鼠的瘤体体积、重量以及肺转移灶结节数均大于对照组，表明过表达ZNF276显著促进乳腺癌皮下成瘤和肺转移（图3）。由此可见，ZNF276在体内外均能促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。

图3 ZNF276促进乳腺癌细胞体内生长和转移

（图源：Lei T，et al., Cell Death Dis, 2022）

为了研究ZNF276影响乳腺癌细胞增殖转移的作用机制，作者使用转录组测序及CUT&Tag联合分析ZNF276作为转录因子能够占据并转录调控的下游靶基因，具体筛选流程如图4。CYP1B1的转录组测序差异倍数（log2FC=4.45）及CUT Tag峰值富集程度（fold enrichment=5.08）较高。有报道称CYP1B1在多种肿瘤组织中的表达均高于正常组织，且促进肿瘤进展[15,16]。此外，CYP1B1通过激活Wnt/β-catenin途径促进细胞增殖和转移[9,10]，因而CYP1B1成为本研究的候选基因。

图4 ZNF276候选靶基因筛选流程图

（图源：Lei T，et al., Cell Death Dis, 2022）

首先，作者通过RT-qPCR、Western blot及双荧光素酶报告基因实验证实ZNF276直接结合CYP1B1启动子并上调CYP1B1的mRNA和蛋白表达水平（图5A-D）。接着作者进一步探索了ZNF276和CYP1B1启动子的功能结合域。通过InterPro网站预测到ZNF276包含锌指相关结构域（zinc finger associated domain，ZF-AD）和C2H2结构域，因而作者对5种ZNF276的ZF-AD和C2H2结构域突变质粒（图5E）和9种CYP1B1启动子截断片段（图5F）。结果证实，ZNF276通过其C2H2结构域结合到CYP1B1启动子的−1127 ~−921 bp区域，从而在转录水平上调控CYP1B1的表达（图5G-I）。

图5 ZNF276调节CYP1B1启动子的转录活性

（图源：Lei T，et al., Cell Death Dis, 2022）

考虑到CYP1B1与Wnt/β-catenin通路的相关性，作者下一步采用Western blot、RT-qPCR、TOP/FOP及免疫荧光实验探究ZNF276与Wnt/β-catenin通路活性的相关性。结果发现，ZNF276通过促进CYP1B1介导的β-catenin核转位和下游靶基因表达，从而激活Wnt/β-catenin通路（图6）。

图6 ZNF276通过调节CYP1B1激活Wnt/β-catenin通路

（图源：Lei T，et al., Cell Death Dis, 2022）

为进一步探索ZNF276调控CYP1B1转录表达的分子机制，作者采用免疫沉淀联合质谱技术对其互作蛋白进行分析。在所有ZNF276潜在的互作蛋白中，MAGEB2（肽段数=10）引发了作者的研究兴趣。MAGEB2在多种癌症中高表达，是潜在的肿瘤标志物[11，12]。MAGEB2也在肿瘤增殖和转移中发挥重要作用[17]。此外，鉴于MAGEB2可以与HDAC[17]相互作用增强E2F转录因子活性，作者选择MAGEB2作为ZNF276的候选互作蛋白进行研究。

通过免疫共沉淀、ChIP-PCR、荧光素酶实验等手段，研究证实MAGEB2与ZNF276相互作用，并促进ZNF276介导的CYP1B1转录调控和Wnt/β-catenin信号激活（图7A-I）。通过功能恢复实验，作者发现过表达MAGEB2可显著回补沉默ZNF276后乳腺癌细胞增殖和迁移能力的减弱（图7J-K）。

图7 ZNF276通过招募MAGEB2激活Wnt/β-catenin通路来调节CYP1B1转录

（图源：Lei T，et al., Cell Death Dis, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

总之，该研究首次描述了ZNF276在乳腺癌组织和细胞中的表达，并阐明了ZNF276通过激活Wnt/β-catenin途径促进细胞增殖、迁移和侵袭的新机制。该研究拓宽了人们对ZNF家族蛋白调控乳腺癌发生发展的认知，并为Wnt/β-catenin途径相关治疗提供新的策略。值得思考的是，由于转录调控模式的多样性，相同的ZNF蛋白可能在不同癌症中发挥不同的作用，因而ZNF276在其他癌症中的作用机制仍有待探索。此外，该研究推测ZNF276介导的CYP1B1激活和β-catenin核转位可能是Wnt/β-catenin通路的一种新机制，而这并非是ZNF276显著调控并导致细胞增殖、迁移和侵袭的唯一通路。转录组测序和CUT&Tag结果表明，ZNF276表达水平也与细胞周期和代谢途径显著相关。因此，ZNF276的转录调控网络和下游基因表达模式值得进一步关注和探究。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41419-022-05223-8

基金支持：全军卫勤保障能力创新与生成专项编号：20WQ029；全军装备科研项目编号：LB20191A010001；国家自然科学基金青年项目编号：81802634；广东省基础与应用基础研究基金编号：2021A15010168。

通讯作者简介（上下滑动阅读） 

李林海，广州医科大学附属第六医院（清远市人民医院）检验医学部主任、科研部副主任（分管科研平台）、学科办专家组组长、教授、主任技师、医学博士、博士研究生导师。担任中华医学会检验医学分会临床生化学组委员、白求恩精神研究会检验医学分会副会长、广东省医学会检验医学分会副主任委员兼分子诊断学组组长、广东省医疗行业协会医学检验管理分会副主任委员、广东省生物医学工程学会临床实验医学分会副主任委员等职务；国内外发表核心期刊论文近150篇（SCI论文30余篇，单篇最高IF为30），主编专著6部，副主编、参编专著各1部；主持或参与国家、军队、省市课题20余项（可支配经费1500余万元）；获省部级科技进步二、三等奖各4项；发明专利3项、实用新型专利3项、两项成果获得国家试剂盒注册批文。2018年获全军检验医学杰出贡献奖、2019年获全国“白求恩式检验人”荣誉称号。研究方向为乳腺癌的分子机制及新型分子标志物研究；病原微生物的快速分子诊断；便携式检验仪器及试剂的研发。

肖斌，广州医科大学附属第六医院（清远市人民医院）检验医学部主任助理，清远市感染免疫及分子诊断工程技术研究开发中心副主任，医学博士，副主任技师，副教授，硕士研究生导师，担任白求恩精神研究会检验医学分会青年委员、广东省医学会检验医学分会青年委员兼分子诊断学组秘书、广东省医疗行业协会医学检验管理分会委员、广东省生物医学工程协会委员。主要研究方向为1. 肿瘤和感染性疾病的快速分子诊断；2. 表观遗传修饰在乳腺癌发生发展中的作用机制。国内外发表核心期刊论文60余篇（其中SCI论文20篇）；主持国家自然科学基金1项、广东省自然科学基金2项和广州市科技计划1项，参与国家、军队和省市课题11项，在研课题经费累计110万元；另参编专著1部，获得实用新型专利4项。孙朝晖，南部战区总医院检验科主任，医学博士，博士后，主任技师，教授，博士生导师。享受军队优秀专业技术人才岗位津贴。担任全军免疫学学会常委、广东省临床医学会检验分会副主委、广东省基层医药学会检验诊断分委会副主委、广东省生物医学工程学会临床实验分委会副主委、广东省基层卫生协会检验分会副主委。主持国家、军队、省级科研基金13项；获广东省科技进步二等奖第一作者1项，军队科技进步二等奖1项，军队科技进步三等奖2项等；共计发表第一或通讯作者论文90余篇（SCI收录23篇），主编、副主编专著3部，参编4部，专利1项。

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参考文献（上下滑动阅读） 

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本文完