专家点评 Redox Biol︱Nrf1是维护细胞线粒体稳态而不可或缺的一个氧化还原决定因子

撰文︱张义国

责编︱王思珍，方以一

编辑︱杨彬薇

细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是细胞代谢过程中产生的具有高度氧化活性的一类小分子群，即是代谢活动的副产品，也是维持细胞生命活动不可或缺的信号分子，但是不受控制的ROS则是导致炎性衰老或恶性转为癌症的一个重要元凶[1,2]。在癌症发生发展过程中ROS充当着“双刃剑”的作用，一方面ROS通过激活癌基因抑制肿瘤抑制基因以及作为信号分子来诱导异常细胞生长和转移来发挥致癌作用，而另一方面ROS积累超过临界点时，通过诱导调控细胞程序性死亡或衰老而起着抑癌作用[2]。因此，研究氧化还原稳态维持对于预防炎性衰老及癌症发生、以及治疗肿瘤都有着关键作用。

Nrf1和Nrf2同属于CNC-bZIP家族成员，研究人员目前已经知道Nrf2在维持细胞氧化还原稳态在中发挥着至关重要的作用，Nrf2不仅能够调节谷胱甘肽、硫氧还蛋白和 NADPH 这三大抗氧化分子的生物合成、利用和再生，还能够通过线粒体和 NADPH 氧化酶控制活性氧的产生。此外，还影响线粒体膜电位、脂肪酸氧化、有氧呼吸底物的使用和ATP合成[3,4]。但是对Nrf1体系的功能和机制知之甚少，而且对Nrf1和Nrf2在氧化还原稳态维持过程中如何进行分工和协调仍不明确。

2022年9月13日，重庆大学附属江津医院张义国教授团队在国际氧化还原生物学与医学学会及欧洲自由基研究学会官方期刊Redox Biology发表了题为“Nrf1 is an indispensable redox-determining factor for mitochondrial homeostasis by integrating multi-hierarchical regulatory networks”的研究，揭示了Nrf1作为一个线粒体稳态维持而不可缺失的氧化还原决定因子，通过整合多层级联调控网络来维持细胞氧化还原稳态。

首先，研究者通过检测Nrf1和Nrf2的敲除细胞系中的ROS水平，发现Nrf1和Nrf2的敲除均会带来细胞中ROS水平的上升，但是Nrf1敲除后细胞中的ROS水平和氧化损伤程度要显著高于Nrf2敲除细胞系（图1）。对抗氧化基因的检测发现Nrf1敲除后细胞中Nrf2的蛋白水平异常升高并带动细胞中抗氧化基因表达的上调，但是由Nrf1缺失而增加的ROS和氧化损伤并没有因为Nrf2的急剧升高消除（图1）。

图1 Nrf1和Nrf2敲除细胞的氧化还原状态和抗氧化基因表达

（图源：Shaofan Hu et al., Redox Biol, 2022）

接着，研究者发现Nrf1的缺失会造成线粒体呼吸链损伤，同时线粒体的电镜结果表明，Nrf1^-/-细胞中线粒体形态发生改变且数目减少。由于细胞中绝大多数ROS由线粒体产生，线粒体的损伤会导致线粒体ROS的产生增多，这也表明Nrf1敲除细胞中升高的ROS是由线粒体产生增多导致的（图2）。

图2 Nrf1和Nrf2敲除后线粒体形态和线粒体亚基表达

（图源：Shaofan Hu et al., Redox Biol, 2022）

随后，研究者通过荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹、双荧光素酶报告基因实验等一系列实验证明了Nrf1能够通过直接调控PGC1α、αPalNRF1和GABPNRF2调控线粒体的稳态（图3）。

图3 Nrf1和Nrf2对线粒体相关转录因子的调控作用

（图源：Shaofan Hu et al., Redox Biol, 2022）

接着，研究者发现Nrf1敲除后会出现Warburg效应，细胞中糖酵解和脂肪酸合成升高，而升高的糖酵解增加了细胞中的ROS产生，通过RNA干扰实验发现Nrf1敲除敲除细胞中升高的糖酵解和脂肪酸合成相关基因的上调是细胞中Nrf2蛋白水平升高导致的，这表明Nrf2 增强糖酵解以满足细胞能量需求，但增强的糖酵解流也加重Nrf1缺失所导致的线粒体压力（图4）。

图4 代谢相关基因的表达及对ROS的影响

（图源：Shaofan Hu et al., Redox Biol, 2022）

研究者还发现了Nrf1^-/细胞中下调的UCP2也进一步升高了细胞中的ROS，UCP2是一种解偶联蛋白，当电子传递链中的电子传递受阻时能通过减少线粒体内膜两侧的质子浓度差来减少线粒体ROS的产生[6]。而在Nrf1^-/细胞中升高的Nrf2通过microRNA抑制了UCP2的表达，者使得在线粒体受损的背景下线粒体ROS的产生进一步增加。

图5 Nrf1和Nrf2通过microRNA负调控UCP2影响ROS

（图源：Shaofan Hu et al., Redox Biol, 2022）

此外，研究者还发现Nrf1敲除后细胞中线粒体应激相关基因下调，线粒体应激在线粒体受损时能够通过一系列通路促进线粒体的修复[7,8]，但是当Nrf1敲除后细胞的线粒体应激激活机制受到明显的抑制（图6）。

图6 Nrf1而不是Nrf2影响细胞中线粒体应激的激活

（图源：Shaofan Hu et al., Redox Biol, 2022）

最后，研究者发现了Nrf1^-/细胞中EMT过程被激活，同时细胞中的MAPK、HIF1α、NF-ƙB、PI3K/AKT通路均被激活，而抑癌基因P53、PTEN的表达受到抑制，这说明Nrf1的敲除促进癌症发生发展相关通路，这为癌症的预防和治疗提供了新的靶点和思路（图7）。

图7 ROS相关信号通路的变化

（图源：Shaofan Hu et al., Redox Biol, 2022）

图8 总结模式图

（图源：Shaofan Hu et al., Redox Biol, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望综上所示，研究者发现Nrf1的敲除导致细胞中的ROS水平和细胞氧化应激指标（包括脂质过氧化水平）均有着较大幅度的增加，且增加的ROS和氧化损伤并没有因为Nrf2的急剧升高消除（图8）。Nrf1能够通过PGC1α、核呼吸因子1和核呼吸因子2决定线粒体稳态的维持（图8）。当Nrf1敲除后，细胞出现非常明显的氧化损伤以及数目降低，从而大幅度提高了线粒体ROS产生（图8）。同时Nrf1还是线粒体应激响应(UPRmt)机制所必须的一个“质控”因子。研究者还发现Nrf1敲除后出现Warburg效应及细胞恶性转化增殖机理，并揭示Nrf1和Nrf2这一对抗氧化转录因子通过负调控UCP2促进ROS的产生并增加能量产出，这也说明Nrf1和Nrf2这一对阴阳调和的转录因子对氧化还原稳态的维持是多角度，多层次的，同时也将抗氧化与能量代谢紧密联系起来（图8）。最后研究者发现了Nrf1的敲除激活了肿瘤发生发展的相关通路，为进一步研究Nrf1和Nrf2在氧化还原稳态以及失衡应激导致炎性衰老和肿瘤发生发展中的管控作用机制提供了新的思路（图8）。当然，该研究还存在着某些局限，对线粒体应激的相关机制研究还不完善，没有发现线粒体应激被抑制的原因，同时对与细胞的EMT进程和肿瘤相关通路激活的具体机制还不明确，需要进一步进行研究。
专家点评专栏一、刘健康（康复大学特聘教授，兼任西安交通大学领军学者讲座教授）众所周知，我们的内源性抗氧化防御系统主要受到两个关键CNC-bZIP家族转录因子Nrf1和Nrf2的调节。Nrf2抗氧化系统已被充分研究，因此我们清楚地知道Nrf2在维持细胞氧化还原稳态在中发挥着至关重要的作用。Nrf2不仅能够调节谷胱甘肽、硫氧还蛋白和 NADPH这三大抗氧化分子的生物合成、利用和再生，还能够通过线粒体和 NADPH氧化酶控制活性氧的产生。此外，Nrf1还影响线粒体膜电位、脂肪酸氧化、有氧呼吸底物的使用和ATP合成[1, 2]。因此，Nrf2激活剂已被证明是许多疾病预防和治疗的关键调控节点和策略[3]。然而，与Nrf2系统相比，我们对Nrf1系统的功能和机制知之甚少，而且两者在氧化还原稳态维持过程中如何进行分工和协调仍不明确。

现在，我们很高兴看到重庆大学张义国教授团队最近于《Redox biology》[4]发表的论文表明，Nrf1的缺失导致细胞中ROS水平和氧化损伤急剧增加，即使抗氧化系统由于极度活跃的Nrf2而大大增强，但是增加的ROS和氧化损伤并没有因为Nrf2的急剧升高消除。这是一个重要的发现，因为它证明了Nrf1不仅能够调控抗氧化系统，还参与了ROS产生的管控机制，这是氧化还原生物学领域一直会被问到的一个关键科学问题。

作者进一步揭示，Nrf1缺失导致的ROS的增加是由于线粒体氧化呼吸链的损伤及调节其表达的核呼吸因子αPalNRF1和GABPNRF2下调所致。我们都知道线粒体是ROS的主要来源，同时ROS会导致线粒体功能障碍，而这一发现清楚地告诉我们，Nrf1缺失是导致线粒体损伤的决定因素，进而导致ROS的产生和细胞氧化损伤。

此外，作者还发现了异常升高的Nrf2增强糖酵解以满足细胞能量需求，但增强的糖酵解流也加重其线粒体应激。并且Nrf1和Nrf2通过miR-195和mIR-497介导的UCP2途径差异调节ROS的产生。这些发现很好地回答了Nrf1和Nrf2如何在氧化还原稳态相互协调的问题。

综上所述，张义国教授团队通过整合多层次调控网络，发现Nrf1是线粒体稳态不可缺少的氧化还原决定因子。这是氧化还原生物学的一个里程碑式工作，因为它不仅在理论上具有重要意义，而且在预防和治疗炎性衰老、恶化癌症等疾病方面也具有临床应用。

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二、黄蓬（中山大学教授），刘湜桦（中山大学博士后）

氧化还原代谢及其稳态的维持是细胞最基本的生命活动之一，而线粒体在维持氧化还原稳态中起关键作用。该文章通过对Nrf1α和Nrf2基因敲除细胞模型的研究，发现Nrf1α对细胞维持线粒体内氧化还原稳态必不可少。Nrf1和Nrf2相互调控，并通过其转录因子的功能向基因表达网络发出多层次的信号整合和局部微调，从而保持细胞和线粒体的氧化还原平衡和能量代谢稳态。作者一方面解释氧化还原稳态的多维调控机制，另一方面阐明了Nrf1和Nrf2对线粒体氧化稳态调控的重要差别，对Nrf1和Nrf2通过不同的机制在氧化还原调控过程中的不同作用提供了新颖的思路和实验依据。传统观点认为Nrf2是调控氧化还原稳态的“总开关”（Master switch），然而，作者发现敲除Nrf1α时导致细胞产生严重的氧化应激，尽管Nrf2显示明显的代偿性上调，仍然不能阻止细胞内和线粒体中ROS的明显升高；而敲除Nrf2时，虽然细胞ROS明显升高，却未见Nrf1的代偿性改变。因此，Nrf1才是迄今所发现最有实力的一个氧化还原稳态决定因子。

值得注意的是，Nrf1α的缺失会导致线粒体氧化磷酸化代谢功能受损，ROS升高并促进糖酵解，诱导上皮-间质转化（EMT），并通过激活MAPK、HIF1α、NF-κB、PI3K和AKT等信号通路促进肿瘤细胞的存活，这可能促进肿瘤的的发展。因此，试图通过靶向抑制Nrf1而治疗肿瘤似乎不是一个可取的策略。相反，敲除Nrf2并不引起Nrf1的代偿性升高，Nrf2敲除的细胞丧失了重要的抗氧化响应机制，导致细胞内活性氧严重积聚并可能对肿瘤细胞造成明显损伤。因此，抑制Nrf2功能可能是一种有效的抗肿瘤策略，这与抑制Nrf1明显不同。最值得关注的是，该研究提示Nrf1是Nrf2的负性调控分子，能通过明显影响Nrf2的蛋白水平而调控细胞的内源性抗氧化机制，进而影响细胞的炎症反应和衰老过程。因此，激活Nrf1可能是干预炎症和衰老的重要潜在靶点。综上所述，该项研究不仅增进了我们对细胞氧化还原稳态调控机制的理解，同时具有重要的潜在应用价值。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.redox.2022.102470

通讯作者：张义国（左）；点评专家：刘建康（中）、黄蓬（左）

（照片提供自：张义国/刘建康/黄蓬团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读） 

张义国教授，张义国教授20多年专注探究氧化还原阈值决定的“根性”基础科学问题，阐明抗氧化解毒的跨膜转录因子Nrf1（也称Nfe2l1）以及同源家族分子Nrf2/3的细胞生化与其缺失所致不可控炎症恶性转化的病理生理学机制，独树一帜地创建了一套拓扑生物学理论构架，包括新创的四个概念英文词汇（topogon，topovectorial，topoform，topogenetics），解析了“运动性膜蛋白类”（moving membrane-protein）抗氧化转录因子Nrf1翻译后加工机制——取决于其在内质网腔膜内外“跨膜翻转”的拓扑决定元与矢量过程, 即拓扑调节性近膜加工（topology-regulated juxtamembrane proteolysis，RJP），从而揭示了拓扑矢量变化对抗氧化基因调控及生物学功能的影响。这一颠覆性发现，截然不同于信号肽加工（发现者Günter Blobel 获1999年度诺贝尔奖）, 更不同于高尔基膜内加工ATF6/SREBP1（由两位诺奖得主Goldstein 和Brown实验室合作完成)。已被哈佛大学Hotamisligild实验室证实（Cell 171, 1094-1109, 2017）后，逐渐被该领域内国际主流接受认可。

之后，张义国带领的“拓扑生物学”研究团队，仍聚集探索Nrf1/2相关拓扑遗传学与拓扑调控机制，建立了数十套本课题研究所需要的独特细胞株系统及关联动物模型，积累了一系列原创性科研成果。在此原创探究基础上，又与理论物理与系统生物学专家敖平教授合作，探索Nrf1/2-介导氧化还原代谢关联的细胞器互作的核心网络构成、对话反馈、动态变化及其生理-病理调控机制，进而阐明其功能紊乱在自发性衰老恶化病理过程中的作用机制、预测化学干预的优化组合方案。

新近研究发现Nrf1是细胞线粒体内稳态维护而不可或缺的一个氧化还原决定因子; 变异体Nrf1D 则是存在于血浆中的第一个分泌型转录因子。总之，Nrf1是集感知（sensor）、传导（transducer）、效应（effector）“三位一体化”复合型拓扑调控分子，即能感知膜内外糖脂、胆固醇和氧化还原态势变化，直接传导产生应答效应。另外，Nrf1也能管控蛋白酶体各亚基基因转录表达，决定清除氧化损伤“垃圾蛋白质”，从而维护细胞内蛋白质稳态。

点评作者简介（上下滑动阅读） 

点评者简介：刘建康教授：本科毕业于西安交通大学，并于日本冈山大学医学院获得医学博士学位。在加州大学伯克利分校布鲁斯艾姆斯博士实验室完成博士后培训后，先后任教于加州大学伯克利分校和欧文分校、奥克兰儿童医院研究所、肯塔基大学医学院和中国科学院上海营养研究所。目前，他担任康复大学特聘教授，同时也是西安交通大学的领军学者讲座教授。其研究兴趣包括与衰老、压力和年龄/压力相关退行性疾病的分子和细胞机制，研究重点是自由基和线粒体生物学和医学。提出了“应激诱导衰老加速的线粒体自由基假说”和“线粒体营养素概念”，在SCI期刊发表论文250余篇，出版图书2本，专著19部。刘健康博士连续8年（2014-2021）荣登“爱思唯尔生物化学、遗传学和分子生物学领域中国高被引科学家”榜单、生命科学世界前1.5%科学家和中国生命科学前百强学者（2021）。

点评者简介：黄蓬教授：毕业于美国德州大学生物医学研究生院，历任美国德州大学M.D. Anderson Cancer Center助理教授、副教授和终身教授。现任中山大学教授，长期从事肿瘤代谢及其调控、线粒体代谢和氧化还原平衡机制及靶向肿瘤代谢的抗癌新药研究。主要研究成果包括揭示肿瘤代谢异常和氧化还原代谢调控机制失调及其临床意义，阐明重要癌基因对肿瘤代谢异常的调控机制以及代谢异常引起的耐药机制，并研发针对代谢调控关键靶点的抗肿瘤药物和防治策略。代表性论文发表于Nature、Cancer Cell、Nat Med, Nat Cell Biol、Nat Rev Drug Disc、Blood、Redox Biol等国际高影响学术刊物，近6年连续被评为生化遗传和分子生物学领域高被引学者。

点评者简介：刘湜桦博士：毕业于中山大学，目前在中山大学做博士后研究，聚焦于ROS和氧化还原信号对肿瘤发生发展的影响和调控机制，特别是ROS对基因表

达和蛋白质稳态的影响及其分子机制的研究。

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参考文献（上下滑动阅读） 

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本文完