Cell Prolif︱李齐发/杜星团队揭示TGF-β1调控卵巢颗粒细胞转录组变化的普遍机制

撰文︱李琦琦，杜星，李齐发

责编︱王思珍，方以一

编辑︱杨彬薇

卵泡是雌性生殖系统的基本功能单位，由卵泡膜细胞（Theca cells）、颗粒细胞（Granulosa cells）和卵母细胞（Oocyte）构成，其正常发育对于维持雌性生殖过程至关重要[1]。雌性哺乳动物原始卵泡库中卵泡数量巨大，但仅有极少数卵泡（<1%）能够发育成熟并排卵，闭锁退化是绝大多数卵泡的最终命运[2]。目前，普遍认为颗粒细胞凋亡是引发卵泡闭锁的主要诱因[3]，但前者的调控机制尚不清楚。因此，探究并阐明颗粒细胞凋亡的精准调控机制对于维持雌性哺乳动物繁殖力具有重大意义。

研究发现颗粒细胞凋亡受到一个由体内外多因素组成的复杂网络调控，主要包括生长因子和表观调控因子等[4]。转化生长因子β1（TGF-β1）是一个在雌性哺乳动物生殖系统中高表达的多功能因子，其表达或功能缺失会导致颗粒细胞转录组变化[5]，但TGF-β1参与上述过程的机制尚不明晰。另外，近期研究还发现长链非编码RNAs（LncRNAs）作为一类重要的内源性表观因子参与调控卵泡发育进程[6, 7]。然而，TGF-β1与lncRNAs互作是否以及如何参与调控雌性哺乳动物卵巢颗粒细胞状态尚不明确。

2022年9月20日，南京农业大学李齐发教授/杜星副研究员团队在Cell Proliferation上发表了题为“TGF-β1 regulates the lncRNA transcriptome of ovarian granulosa cells in a transcription activity-dependent manner”的研究论文。该研究揭示了TGF-β1对卵巢颗粒细胞转录组的调控模式与普遍机制，进一步解析了TGF-β1通过lncRNAs抑制颗粒细胞凋亡的分子机制，为阐明雌性哺乳动物繁殖力的表观调控机制提供新的见解。

作者首先利用转录组测序技术检测了10ng/ml TGF-β1对卵巢颗粒细胞lncRNA转录组的影响，结果共鉴定得到7586个包含6种不同类型的lncRNAs（图1A-C）。特征分析发现相较于mRNAs，lncRNAs表达丰度较低、转录本较短且外显子数较少。染色体定位分析发现lncRNAs分布不均，具有一定的染色体偏好性（图1D-I）。进一步对数据进行挖掘共鉴定得到1281个差异表达lncRNAs，其中72个lncRNAs对TGF-β1高度敏感（|log₂(FC)≥3|），有趣的是，染色体定位分析发现上述lncRNAs同样具有一定的染色体偏好性（图2）。上述结果表明TGF-β1可引起卵巢颗粒细胞中lncRNA转录组发生剧烈变化。

图1 TGF-β1处理后卵巢颗粒细胞lncRNA转录组的鉴定与特征分析

（图源：Li QQ, et al., Cell Prolif, 2022）

图2  对TGF-β1高度敏感的差异表达lncRNAs鉴定

（图源：Li QQ, et al., Cell Prolif, 2022）

作为竞争内源性RNA（ceRNA）是lncRNAs发挥功能的主要方式之一。作者结合前期研究成果[8]在卵巢颗粒细胞中构建了TGF-β1介导的差异表达RNAs互作-通路富集-细胞功能调控网络。进一步利用生物信息学分析发现该调控网络中的核心RNAs分子通过多种重要的信号通路（包括TGF-β、Wnt、NF-κB、p53和PI3K-Akt等）全面参与调控颗粒细胞关键生物学过程（包括凋亡、增殖、周期、活力以及刺激应答等）（图3A-C）。上述分析结果表明基于ceRNA途径的RNAs互作网络潜在介导TGF-β1诸多重要的生物学功能。

图3 TGF-β1介导的RNAs互作-富集通路-细胞功能调控网络

（图源：Li QQ, et al., Cell Prolif, 2022）

依赖SMADs的核转录活性是经典TGF-β信号通路调控靶基因转录的主要方式。因此作者猜想TGF-β1可能通过上述作用模式对颗粒细胞中lncRNA转录组进行调控。为了验证这一猜想，作者首先利用生物信息学分析发现约有75%差异表达lncRNAs启动子上含有至少2个潜在的SMAD4结合位点（图4C），同时通过染色质免疫沉淀等试验证实SMAD4作为转录因子与差异表达lncRNAs启动子结合，且TGF-β1处理显著促进SMAD4的结合丰度（图4D）。作者结合前期研究成果[9]进一步发现不仅是差异表达lncRNAs，绝大多数TGF-β1诱导的差异表达mRNAs（>95%）和miRNAs（>84%）启动子上也至少含有2个潜在的SMAD4结合位点（图4A, B）。上述发现表明依赖SMAD4核转录活性与配体依赖性途径是TGF-β1调控卵巢颗粒细胞转录组变化的普遍机制。

图4  转录因子SMAD4对于TGF-β1介导的转录组调控至关重要

（图源：Li QQ, et al., Cell Prolif, 2022）

作者随后关注了一个对TGF-β1高度敏感的关键lncRNA，即MSTRG.266432.2。利用RACE试验发现其是一个转录本长度为617nt的lncRNA（图5A），染色质定位发现其位于雌性繁殖力相关基因TEX14第一内含子中（图5B），后将其命名为TEX14-intron transcript 1（TEX14-IT1）。调控分析发现TGF-β1以SMAD4依赖性的方式促进TEX14-IT1转录，且该过程独立于其宿主基因（图5C-H）。机制解析证实转录因子SMAD4可与TEX14-IT1启动子区特异性结合进而促进后者转录，而TGF-β1处理可显著促进SMAD4的结合丰度与核转录活性（图5I, J）。

为了进一步验证lncRNAs能否介导TGF-β1在卵巢颗粒细胞中的生物学功能，作者通过一系列共转试验检测发现敲减内源性TEX14-IT1可显著抑制TGF-β1的抑凋亡功能（图6A）、损害TGF-β1对细胞凋亡标志因子表达的抑制作用（图6B, C），同时破坏TGF-β1对颗粒细胞膜完整性的维持功能（图6D）。上述结果表明包括TEX14-IT1在内的lncRNAs对于维持TGF-β1抑凋亡功能的完整性至关重要。

图5 TGF-β1以SMAD4依赖性方式促进TEX14-IT1转录

（图源：Li QQ, et al., Cell Prolif, 2022）

图6 TEX14-IT1介导TGF-β1在卵巢颗粒细胞中的抑凋亡功能

（图源：Li QQ, et al., Cell Prolif, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究全面系统地解析了转化生长因子β1（TGF-β1）对卵巢颗粒细胞lncRNA转录组的影响，鉴定了对TGF-β1高度敏感的差异表达lncRNAs。重要的是，该研究揭示了TGF-β1调控颗粒细胞转录组变化的普遍机制，即依赖配体和SMAD4核转录活性。此外，作者构建了TGF-β1介导的功能调控网络，功能分析指出包括TEX14-IT1在内的lncRNAs对于颗粒细胞中TGF-β1抑凋亡功能的完整性至关重要。但目前仍有一个问题尚未完全明晰，即TGF-β1通过何种机制调控启动子不含有SMAD4识别位点的靶基因转录，且SMAD4通过何种机制精准调控下游靶基因的表达模式。总之，该研究指出了TGF-β1调控细胞转录组变化的普遍机制，为全面了解TGF-β1对雌性哺乳动物卵泡发育的调控机制提供新鲜视角，并为进一步阐明雌性哺乳动物繁殖力的表观调控机制提供新的见解。
原文链接：http://doi.org/10.1111/cpr.13336
南京农业大学动物科技学院博士研究生李琦琦为论文第一作者，杜星副研究员为通讯作者，团队负责人李齐发教授指导本研究。该研究获得国家自然科学基金项目（31902130）支持。

第一作者：李琦琦（左），团队负责人：李齐发教授（中），通讯作者：杜星副研究员（右）

（照片提供自：李齐发/杜星团队）

主要作者简介（上下滑动阅读） 

李齐发，教授，博士生导师，南京农业大学动物科技学院遗传育种系系主任，统计遗传与表观组团队负责人。长期致力于母猪繁殖性状的遗传基础与表观遗传调控研究。以通讯作者身份在Mol Ther Nucle Acids、Antioxidants、Cell Death Dis、Cell Death Discov、Biol Repro以及Anim Genet等学科主流权威期刊发表科研论文100余篇。先后主持或作为骨干参与国家自然科学基金、国家973计划、国家重点研发计划以及国家自然科学基金重点项目等课题30余项。

杜星，南京农业大学副研究员。主要从事动物遗传育种工作，致力于猪功能基因组学和母猪繁殖性状的精准表观遗传调控网络鉴定等研究。目前，主持包括国家自然科学基金青年基金项目等5项、参与国家自然科学基金等各类项目5项。近五年以第一/通讯作者身份在Cell Death Dis、Communi Biol、Cell Prolif、J Cell Sci、Cell Death Discov、Front Cell Dev Biol以及Theriogenology 等领域学科主流期刊发表20余篇研究论文，获批国家发明专利1项。

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参考文献（上下滑动阅读） 

[1] Botta D, Fuller MJ, Marquez-Lago TT, et al. Dynamic regulation of T follicular regulatory cell responses by interleukin 2 during influenza infection. Nat Immunol. 2017. 18(11):1249-1260.

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[5] Ingman WV, Robertson SA. The essential roles of TGFB1 in reproduction. Cytokine Growth Factor Rev. 2009. 20(3):233-239.

[6] Du X, Liu L, Li QQ, et al. NORFA, long intergenic noncoding RNA, maintains sow fertility by inhibiting granulosa cell death. Commun Biol. 2020. 3(1):131.

[7] Yao W, Pan ZX, Du X, et al. NORHA, a novel follicular atresia-related lncRNA, promotes porcine granulosa cell apoptosis via the miR-183-96-182 cluster and FoxO1 axis. J Anim Sci Biotechnol. 2021. 12(1):103.

[8] Li QQ, Du X, Wang LF, et al. TGF-β1 controls porcine granulosa cell states: a miRNA-mRNA network view. Theriogenology. 2020. 160:50-60.

[9] Liu L, Li QQ, Yang L, et al. SMAD4 feedback activates the canonical TGF-β family signaling pathways. Int J Mol Sci. 2021. 22(18):10024

本文完