STAR Protocols︱臧星星团队发表利用基于NK细胞人源化肿瘤模型评估 KIR3DL3 阻断性抗体肿瘤免疫治疗的实验方案
自然杀伤细胞（Natural killer cells，NK细胞）作为机体重要效应性免疫细胞之一，具有快速有效识别和杀死肿瘤细胞的能力。基于NK细胞的抗肿瘤免疫疗法目前在多种血液系统恶性肿瘤和实体瘤患者中开展了临床试验并取得了令人鼓舞的效果[1]。目前，如何体外大量扩增人原代NK细胞以及增强其抗肿瘤活性是基于NK细胞的免疫疗法的临床前研究及临床应用中所面临的主要困难和挑战。
2022年11月4日，美国爱因斯坦医学院的臧星星教授团队在Cell子刊STAR Protocols上发表了题为“Protocol for evaluating antitumor activity of KIR3DL3 blockade in an NK cell-based xenogeneic lung tumor model”的实验方案文章，该文章提供了一种经过优化的从人体外周血样品中分离和大规模扩增原代KIR3DL3+ NK细胞的详细实验方案，并评估了其自主开发的抗KIR3DL3阻断性抗体在基于人NK细胞的肺肿瘤小鼠模型中的抗肿瘤活性。在此之前，臧教授团队揭示了KIR3DL3是B7家族成员HHLA2的第二个但具免疫抑制功能的受体，主要表达在CD56dim NK细胞和终末分化效应记忆性CD8+ T细胞表面。其自主开发的抗KIR3DL3单克隆抗体可以阻断HHLA2-KIR3DL3通路并能显著抑制人肿瘤细胞在体内的生长，表明阻断该免疫检查点通路是一种全新的肿瘤免疫治疗方法[2-3]。（拓展阅读：臧星星课题组相关研究进展，详见“岚翰生命科学”报道（点击阅读）：JCI︱臧星星团队发现KIR2DL5-PVR免疫检查点通路有望成为肿瘤免疫治疗新靶点；Nat Commun︱臧星星团队发现免疫检查点抑制剂耐药的新机理和新疗法；Sci Adv︱臧星星团队首次发现免疫检查点B7-H3是代谢和肥胖的调节分子）
目前临床研究使用的NK细胞90%以上来源于人体外周血，所用体外扩增NK细胞的方法也不尽相同[4]。在以往研究的基础上，作者详细阐述了体外大量扩增KIR3DL3+人原代NK细胞的实验方案并提供了详细的试剂和方法。在本方案中，作者利用人体外周血作为NK细胞来源，通过富集和流式细胞术分离KIR3DL3+ NK细胞，利用自体外周血淋巴单个核细胞作为滋养细胞，在白介素2（IL-2）和白介素15 （IL-15）和抗CD3抗体的共同激活下，实现了在2-3周内KIR3DL3+ NK细胞高达900倍的大量扩增，而且扩增后NK细胞表面的KIR3DL3表达稳定，为后续体内试验提供充足的NK细胞（图1）。
图1 KIR3DL3+ NK细胞体外扩增效率及扩增后KIR3DL3表达的检测
（图源：Ren X et al., STAR Protoc, 2022）
在这一工作中，作者利用自主开发的抗KIR3DL3特异性单克隆抗体，通过基于流式细胞术的NK细胞杀伤实验，首先在体外验证了该抗体可以显著增强KIR3DL3+ NK细胞对HHLA2阳性的人肺癌细胞系HCC827的细胞毒性作用。作者接着详细描述了评估体内阻断KIR3DL3抗肿瘤活性的实验方案，通过尾静脉注射表达荧光素酶基因的HCC827细胞到免疫缺陷小鼠中建立人肺肿瘤模型，利用活体影像技术监测KIR3DL3+ NK细胞和KIR3DL3阻断性抗体治疗后肿瘤生长情况。臧教授团队先前研究结果表明，在这一基于NK细胞的肿瘤模型中阻断KIR3DL3-HHLA2通路能显著抑制肿瘤生长[2]。
图2 利用基于人NK细胞的肺肿瘤模型评估阻断KIR3DL3抗肿瘤活性的实验方案
（图源：Ren X et al., STAR Protoc, 2022）
综上所述，该实验方案系统性阐述了利用基于人NK细胞的肺肿瘤模型评估阻断KIR3DL3抗肿瘤活性的实验方案和分析方法，详细描述了经过优化和验证的体外分离以及并大规模扩增人体外周血来源的KIR3DL3+人原代NK细胞的实验流程，为后续靶向NK细胞的抗KIR3DL3单克隆抗体药物的开发提供了临床前研究基础（图2）。该实验方案同时提供了实验过程中的注意事项与常见问题解决方案，可以作为后续研究基于NK细胞的免疫检查点抑制剂疗法的重要参考。
第一作者：任晓新 博士
（照片提供自：爱因斯坦医学院臧星星实验室）
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[2] Wei, Y., Ren, X., Galbo, P. M., et al (2021). KIR3DL3-HHLA2 is a human immunosuppressive pathway and a therapeutic target. Sci Immunol 6,eabf9792.
[3] Zang, X. (2017). HHLA2 and its receptors including TMIGD2. Cold Spring Harbor Asia Conference on Precision Cancer Biology: From Targeted to Immune Therapies, Suzhou, China, 18 to 22 September 2017.
[4] Granzin, M., Wagner, J., Kohl, U., et al (2017). Shaping of natural killer cell antitumor activity by ex vivo cultivation. Front Immunol 8,458. 10.3389/fimmu.2017.00458.
本文完