iScience︱叶邦策团队发表改造益生菌外膜囊泡高效递送新冠病毒抗原，为疫苗开发提供新思路

撰文︱沃  静

责编︱方以一，王思珍

编辑︱杨彬薇

新冠大流行将近三年时间，全球累计确诊新冠肺炎超过6.4亿人，累计死亡超过663万病例^[1]。新冠病毒SARS-CoV-2是一种RNA病毒，在复制翻译过程中更容易发生突变，而变异毒株传播速度极快、传染性增强成为一个紧迫的全球健康问题。现有的疫苗接种可呈现一定的保护力，但奥密克戎毒株（Omicron）等突变株仍容易发生免疫逃逸^[2]。因而，开发一种能够快速组装、运输不同抗原的递送系统对新型新冠疫苗的开发及突发公共卫生事件防治具有巨大的应用潜力。

外膜囊泡(Outer membrane vesicles, OMVs)是革兰氏阴性菌外膜释放的非复制的纳米颗粒，携带各种类似于细菌外膜的蛋白质，在疫苗研发领域受到广泛的关注^[3-5]。目前，工程改造的外膜囊泡已成功应用于单一抗原递送，但对外膜囊泡中多种抗原共同表达的相关研究却非常有限。

近日，浙江工业大学绿色制药协同创新中心叶邦策团队在iScience发表了题为“Engineering Probiotic-derived Outer Membrane Vesicles as Functional Vaccine Carriers to Enhance Immunity against SARS-CoV‑2”的研究论文，研究者建立了基于益生菌来源的外膜囊泡递送系统并成功同时递送了含有SARS-CoV-2病毒刺突蛋白（spike protein，S protein）的受体结合域（Receptor-binding domain，RBD）及RBD非糖基化区域NG06抗原，具有良好的免疫原性和安全性，有望实现同时展示多个抗原并应用于新冠病毒等公共卫生事件的防治。

研究者以红色荧光蛋白（mCherry）作为报告蛋白，通过荧光强度定量抗原在外膜囊泡内腔的锚定量，选择融合表达效果最好的模式即OmpA_{(1-199 aa)}-mCherry的方式（OLm-OMVs）。随后研究者以绿色荧光蛋白（GFP）作为外膜囊泡表面展示报告蛋白，通过GFP与ClyA融合将其展示在OLm-OMVs表面。通过蛋白质印迹法(western blotting)和荧光检测证实外膜囊泡可同时展示两种抗原（mG-OMVs）。

图1 mG-OMVs表征

（图源：Wo J, et al.,iScience, 2022）

为验证递送系统的适用性，研究者拟通过上述递送体系展示新冠病毒抗原。新冠病毒刺突蛋白的RBD蛋白在外膜囊泡表面展示可溶性极差，故而研究者将RBD在外膜囊泡内腔进行表达，并成功得到有功能活性的RBD蛋白（RBD-OMVs）。在此基础上，进一步将NG06（RBD区域的核心肽段）与ClyA融合展示在外膜囊泡表面（NR-OMVs）。通过蛋白质印迹法(western blotting)和酶联免疫吸附测定（ELISA）验证，RBD和NG06同时展示在外膜囊泡内外表面。

图2 NR-OMVs表征

（图源：Wo J, et al.,iScience, 2022）

未成熟的BMDC细胞与NR-OMVs孵育培养发现，细胞表面CD86和MHCII分子相较于对照组表达上调，并且NR-OMVs与WT-OMVs并无明显差异，而处理后的BMDC细胞上清中IL-6、TNF-α显著上调；NR-OMVs处理并未对细胞活性造成影响。综上，基因工程改造的NR-OMVs并未对OMVs的免疫激活能力造成影响。

图3 NR-OMVs促进抗原摄取及BMDC细胞成熟

（图源：Wo J, et al.,iScience, 2022）

为了评价NR-OMVs能否诱导针对RBD的体液免疫反应，研究者以RBD+Alum作为阳性对照，分析了腹腔注射小鼠后抗RBD抗体滴度。结果表明NR-OMVs能够诱导强烈的抗RBD的体液免疫反应。

图4 NR-OMVs免疫小鼠产生特异性抗体

（图源：Wo J, et al.,iScience, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，研究者基于外膜囊泡内外腔同时表达抗原并诱导小鼠产生特异性抗体。该研究提供了一个可拓展展示多抗原的平台，未来在其他疾病及突发卫生事件的防治都可以利用此外膜囊泡递送体系构建疫苗。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.105772

通讯作者：叶邦策

（照片提供自：叶邦策课题组）

作者简介（上下滑动阅读） 

叶邦策教授，国家高层次人才计划(2014年)，教育部新世纪优秀人才支持计划学者(2007年)，上海市教委曙光学者(2006年)，上海市科委优秀学科带头人(2011年)，中国生物医药协会生物芯片委员会委员，中国微生物学会分子微生物学及生物工程专业委员会委员，Biotechnology & Applied Biochemistry期刊副主编，Biotechnology Journal编委，“合成生物学”期刊编委。2016年教育部自然科学二等奖，2008年获上海市技术发明二等奖，2007年获明治乳业生命科学奖。近年来在Cell Host & Microbe, Proc Natl Acad Sci USA, Cell Reports, Cell Chemical Biology, J Am Chem Soc, Angew Chem Int Ed等期刊发表SCI论文300多篇。

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参考文献（上下滑动阅读）

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本文完