Mater Today Bio 综述丨孙达团队评述大肠杆菌Nissle 1917作为一种可定制的药物递送系统用于疾病诊疗研究进展

撰文︱陈豪杰责编︱王思珍，方以一编辑︱杨彬薇

纳米给药系统用于各种疾病(如肿瘤、炎症等)的靶向治疗，增强疗效，降低药物的全身毒副作用[1-3]。除了化学纳米材料外，还开发了类似于细胞膜或细菌的天然仿生递送系统[4-6]。与靶向细胞膜和避免体内免疫反应的配体相比，细菌递送系统通过药物或修饰提供额外的功能，同时保持细菌原有功能[7-9]。人类疾病与细菌密切相关。随着化学生物技术和基因工程技术的发展，基于细菌的诊断和治疗给药系统成为生物医学研究的热点。1890 年出现了第一个结合细菌疗法的肿瘤免疫疗法，它通过给患者注射链球菌来治疗骨肉瘤[10]。许多后续研究表明，包括大肠杆菌 (E. coli)、鼠伤寒沙门氏菌和新梭状芽孢杆菌都可以在肿瘤病灶内定殖[11]。大肠杆菌 Nissle 1917（ECN）具有良好的抗菌、抗炎、调节肠道菌群和兼性厌氧特性[12-14]，对于炎症性肠病（IBD）具有疗效。目前，ECN 是治疗肿瘤和胃肠道疾病最流行的工程菌之一[15-17]。

2023年1月6日，温州大学生命科学研究院孙达副研究员团队在Materials Today Bio在线发表题为“Advances in Escherichia coli Nissle 1917 as a customizable drug delivery system for disease treatment and diagnosis strategies”的综述论文。该文综述了Escherichia coli Nissle 1917（ECN）的益生菌特性，对炎症和肿瘤的生物学作用以及利用表面修饰和基因工程手段改造ECN作为疾病（如癌症、炎症性肠病等）精准诊疗的药物递送系统的策略。并总结了用ECN构建的各种疾病的给药系统的优势、特点以及未来的发展潜力（图1）。温州大学生命科学研究院在读研究生陈豪杰，雷鹏宇，以及嵇豪博士为该论文的共同第一作者，重庆大学生物工程学院吴伟副教授，温州大学生命科学研究院金立波博士，孙达副研究员为该论文的共同通讯作者。国科温州研究院的杨秦斯和彭波副研究员，温州大学生命科学研究院的在读研究生马嘉辉、方依梦、屈琳凯，重庆大学生物工程学院李华为该文章提供指导和支持。

图1.本文主要介绍了工程化ECN治疗IBD和肿瘤的策略。

（图源：Chen H, et al., Mater Today Bio. 2023）

一、ECN菌的特点：ECN对肠道菌群、肠上皮屏障和肿瘤的作用

大量体外实验证明ECN具有抗菌作用（图2）。ECN可调节IBD[25]引起的肠道菌群紊乱。IBD常伴有肠道菌群紊乱，包括链霉菌(Streptomyces)减少和变形杆菌(Proteus bacteria)增加[18,19]。ECN通过F1绒毛和H1鞭毛附着在肠上皮细胞(IECs)上。同时，局部持续分泌抗生素Journal Pre-proof 5(如细菌素MccM和MccH47)拮抗沙门氏菌[20]。此外，ECN能够产生六种铁载体(即儿茶酚肠霉素及螯合物、肟酸异辛催产素、混合铁载体Y ersenin、ChuA蛋白和EfeU蛋白)与其他细菌竞争铁元素。ECN还能抑制致病菌(如肠出血性大肠杆菌)的定植和毒素(如产志贺毒素大肠杆菌)的产生，从而维持肠道菌群的稳定[21,22]。

ECN表达的菌毛和鞭毛直接刺激肠上皮细胞(IECs)产生人β-防御素[23]，人β-防御素可直接杀灭细菌，调节免疫[24]。IBD患者黏膜屏障中β-防御素水平常异常[25]。ECN在一定程度上避免了粘膜细菌附着和侵入引起的炎症。此外，已有研究证明ECN通过影响组织中miRNA的表达来调节炎症。在2,4-二硝基苯磺酸钠肠炎小鼠中，ECN可降低肠道组织中miRNA-155和miRNA-223的表达，且这两个指标与促炎因子IL-1β和TNFα呈正相关。同时，ECN上调miRNA-143，具有抑制先天免疫的作用。ECN可以通过下调基质金属蛋白酶-2和TNF-α的表达来恢复miRNA-143和miRNA-150的表达[26]。

此外，IBD患者肠上皮屏障被破坏，原因是IECs内紧密连接(tight junction, TJ)受损，IECs间渗透性增加，病原体或物质容易进入体循环。小鼠实验研究表明，ECN可促进IECs中TJ蛋白Zonula occludens-1的表达[27,28]。此外研究表明，ECN通过上调TLR-4的表达，抑制RHOA/ROCK2/MLC信号通路的激活(激活该通路会引起TJ蛋白分布的改变和屏障功能的破坏)，从而修复肠上皮屏障的破坏[29,30]。

图2. ECN对肠道菌群、肠上皮屏障在IBD方面的作用

（图源：Chen H, et al., Mater Today Bio. 2023）

全身给药后，ECN在动物模型中定植厌氧肿瘤组织，使其成为治疗肿瘤的一种有前途的益生菌。ECN在自身免疫环境中不破坏或诱导自体外周T细胞耐受[31]。实验表明，ECN静脉注射后可在小鼠骨肉瘤细胞(约109CFU/g肿瘤组织)内定植，定殖时间长达8d。体外实验表明，ECN和热灭活的ECN均可通过PI3K/PTEN/AKT信号通路诱导结肠癌HT-29人结肠癌细胞凋亡，从而通过上调PTEN和bcl2相关蛋白(Bax)，下调AKT而导致结肠癌细胞发生凋亡。另一项研究表明，ECN上清液可有效降低Caco-2癌细胞的活力，并显著降低caspase3/7的活性，以减轻5-氟尿嘧啶(5-Fu)化疗药物对IEC-6细胞的损伤[32]。ECN抑制癌症的确切机制尚不清楚，还需要进一步的研究。

二、表面修饰法改性ECN的相关策略

表面修饰法主要通过静电纺丝、多功能涂层、化学键结合和微囊化等策略对ECN表面进行修饰（图3）。这些修饰的目的是增加靶点粘附性，达到时空释放，对胃肠道环境的耐受性，更好的生物相容性（如降低免疫原性增强血液循环时间）、靶向性和治疗效果。

图3 A.逐层包裹ECN。B.通过静电纺丝制备的聚集在内部或外部粘附的ECN。C.ECN驱动电机。D.链霉亲和素化药物和生物素化ECN结合。E.各种膜涂层的ECN。

（图源：Chen H, et al., Mater Today Bio. 2023）

三、利用基因工程ECN对多种疾病的诊断和治疗

基因工程法包括利用内源基因突变、ECN“胶囊”制备、代谢工程、外源基因表达等基因工程或合成生物学手段对ECN改造，各种质粒如图4所示。内源基因突变的ECN研究主要为了消除其遗传毒性增加安全性。合成生物学策略改造ECN在对其基因启动子的选择方面根据疾病响应条件相关，外源基因表达药物要满足治疗需求，最终达到更加安全、时空释放、长期治疗的效果，同时基因工程改造的ECN作为生物传感器对于监测病情具有很大便利和开发价值。

图4. 各类型基因工程改造的ECN质粒图

（图源：Chen H, et al., Mater Today Bio. 2023）

为了通过ECN的靶向定殖在肠道中分泌表皮生长因子（EGF），Mira Yu将人类EGF基因插入到ECN的基因组中。在小鼠肠道溃疡模型中，EGF-ECN 在预防和损伤后治疗期间均能减轻肠道溃疡，并促进肠上皮层的修复和隐窝祖细胞的增殖[33]。已经开发出一种来自 EGFECN 的人 EGF 的 TP 结合盒 (ABC) 转运蛋白连接分泌物，以增强 EGF 受体的有益作用，如图4.A所示。

通过将具有抗炎特性的基因 Sj16 插入 pGEX4T-1 并将 SJ16 分泌到 ECN 的细胞外空间，构建了 ECNSj16 菌株。 HlyA 分泌系统通常被克隆到细菌基因组中。为了将外源蛋白分泌到 ECN 细胞外空间，作者使用了 HlyA 分泌系统（包括来自鼠疫耶尔森氏菌的 HlyA、HlyB 和 HlyD 基因）[34,35]。作为 DSS 诱导的肠炎小鼠实验的结果，ECN-Sj16 改变了肠道的微生物群落。通过Ruminococcaceae/Butyrate/Retinoic acid轴，Treg细胞增加，Th17减少，炎症减轻。图4.B 展示了质粒上插入成分的信息和作用方式。

通过构建基因回路，工程化的ECN也可以作为IBD的诊断工具，如图4.C所示。当IBD发生时，体内诱导的一氧化氮合酶（INOS）会产生硝酸盐，而炎症产生的ROS会产生硫代硫酸盐。因此，硝酸盐和硫代硫酸盐可作为炎症性疾病的标志物。为了制备生物传感器，Seung Gyun Woo 等人将由（NarX 和 NarL）和（ThsS 和 ThsR）组成的双组分基因回路克隆到 ECN 的质粒中。通过响应双组分（硝酸盐和硫代硫酸盐）以两个输入与逻辑门的形式调控启动子PyeR和PphsA的转录，最终调控sfgfp（报告基因）的表达，IBD的程度通过检测绿色荧光强度来测量[36]。由于双组分反应，避免了误报，例如摄入一些硝酸盐。因此，生物传感器具有良好的依从性和灵敏的反应，用抗炎剂替代sfgfp的基因也可用于治疗IBD。然而，这仍然需要面对临床问题，需要解决如何快速响应并检测报告产品。

使用合成生物学构建 ECN 中未发现的代谢途径通常用于治疗 IBD。 Xu Yan等人将外源性3-羟基丁酸（3HB）（一种结肠炎治疗剂）合成途径插入ECN基因组，构建缺氧启动子pfnrS的ECNL4，在肠道厌氧环境中最大限度地产生3HB。插入质粒的组分如图4.D所示。 DSS诱导小鼠结肠炎实验表明，该菌株可通过定植持续产生3HB，直接治疗肠道炎症。结果显示，工程菌还可以通过增加AKK益生菌的丰度，产生大量短链脂肪酸，间接缓解肠道炎症，从而调节肠道。与常规口服剂量的3HB相比，修饰的ECNL4治疗肠道炎症更有效。

四、总结与展望

可定制的ECN药物递送系统要达到加强对药物的保护，减少药物使用和毒性，增强靶向性，才能被设计成用作诊断疾病的传感器或达到增强药物治疗效果。基因工程或材料表面修饰开发ECN递送系统仍取决于疾病、给药方式和患者。

另外工程化ECN仍存在一定的问题：

1. ECN 由于其抗菌特性而具有遗传毒性，这要求 ECN 的毒力因子与其抗菌特性脱钩。在已知研究中，C1bP 基因的点突变已被证明可以在保持抗菌活性的同时使遗传毒性失活。未来对毒力因子和突变株的研究可能会解决这个问题。

2.  ECN治疗各种疾病的作用机制仍有待研究。

3. 一些在动物实验中有效的工程化 ECN 菌株在临床试验中并不理想，例如 SYNB102，工业化生产也将面临未知的挑战。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2023.100543

通讯作者:孙达

（照片提供自：孙达团队）

作者简介（上下滑动阅读）

孙达，博士&副研究员&硕导&温州大学生命科学研究院院长助理。担任Theranostics、Journal of Materials Science & Technology、Journal of Nanobiotechnology、Science of the Total Environment、Frontiers in Bioengineering and Biotechnology、Life Sciences等多个国际期刊审稿专家。先后主持科学研究项目5项，并参与7项科学研究项目，3项平台申请与建设项目。在Materials Today Bio、Theranostics、Frontiers in Nutrition、Materials Science & Engineering C、Pharmaceutics、 Frontiers in Pharmacology等国内外学术刊物上发表论文68篇（累计IF＞300），其中第一/通讯作者论文40余篇（累计IF＞200），获授权发明专利9项。

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本文完