PLoS Pathog︱病原菌可通过调节宿主CDC42乙酰化修饰促进结直肠癌发生发展
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三大常见癌症和第二大癌症相关死亡原因[1]。越来越多的研究表明，细菌可以促使CRC的发展[2,3]。研究发现肿瘤组织比正常组织中存在更多的细菌，并且在CRC、乳腺癌和卵巢癌组织中都发现了沙门菌（Salmonella）[4]。沙门菌是世界上最常见的食源性病原菌之一，可在不同宿主中引起多种疾病[5]，其导致的消化道感染症状，可能与CRC发展有关[3,6,7]，但是其在CRC发生发展中的作用和机制还有待阐明。
2023年2月22日，上海交通大学医学院姚玉峰课题组联合附属瑞金医院卢捷课题组在PLoS Pathogens上发表了题为“Bacterial infection promotes tumorigenesis of colorectal cancer via regulating CDC42 acetylation”的研究。该研究利用质谱技术发现沙门菌感染导致宿主细胞很多蛋白质的乙酰化修饰水平发生改变，其中包括与感染和癌症都密切相关的RhoGTP酶家族成员CDC42（Cell division cycle 42）。研究阐明了沙门菌感染调控宿主CDC42 K153乙酰化修饰水平促进CRC发生发展的机制，对深入理解细菌操纵宿主蛋白质翻译后修饰与CRC发生发展之间的关系的研究提供了科学范例。
为了探索细菌感染对宿主细胞蛋白质乙酰化修饰的影响，作者用鼠伤寒沙门菌感染人U937细胞，采用SILAC定量质谱技术分析感染后细胞中蛋白质乙酰化修饰水平变化（图1A），发现感染导致细胞中多个蛋白质的赖氨酸（K）位点上乙酰化修饰水平发生改变。通过KEGG分析（图1B）以及蛋白互作网络（图1C）对乙酰化修饰水平改变的蛋白质进行分析，关注到与感染和癌症都密切相关的CDC42，其K153位点的乙酰化修饰水平在感染后发生了降低（图1D），并通过免疫印迹进行了确认（图1E）。CDC42 K153在不同物种中高度保守（图1F），提示CDC42 K153乙酰化修饰可能是普遍存在的。
图1. 沙门菌感染改变宿主蛋白质的乙酰化修饰
(图源： Wang DN, et al., PLoS Pathog. 2023)
作者分析晶体结构（PDB ID：5UPK）发现，CDC42 K153乙酰化修饰水平降低可能会影响CDC42和PAK4的结合（图2A）。为验证这一假设，作者通过免疫共沉淀实验和免疫印迹检测发现，感染减弱了CDC42与PAK4的结合（图2B），并且模拟非乙酰化形式的点突变（K153R）也削弱了CDC42与PAK4的结合（图2C）。但K153乙酰化修饰不影响CDC42和PAK1的结合（图2B和图2D），以及CDC42的GTP酶活性（图2E）。以上结果提示CDC42和PAK4的结合减弱是由于K153乙酰化修饰水平降低导致的，而不是因为CDC42的GTP酶活性受到影响而造成的。
图2. K153乙酰化修饰对CDC42与PAK4的结合至关重要
(图源： Wang DN, et al., PLoS Pathog. 2023)
通过加入去乙酰化酶家族的抑制剂，发现CDC42 K153的去乙酰化酶很可能属于SIRT家族成员（图3A）。作者验证了CDC42与SIRT2存在互作，并且在体内外都可以去乙酰化CDC42 K153（图3B-图3D）。在SIRT2稳定敲低细胞株中，沙门菌感染不再降低K153乙酰化（图3E）,也不再影响CDC42和PAK4的结合（图3F）。以上结果说明SIRT2是K153的去乙酰化酶。
图3. SIRT2是K153的去乙酰化酶
(图源： Wang DN, et al., PLoS Pathog. 2023)
通过对乙酰基转移酶进行筛选，发现p300/CBP在体内外均可乙酰化CDC42 K153（图4A、图4B和图4D），抑制p300/CBP的活性导致CDC42和PAK4的结合减弱（图4C）。以上结果提示p300/CBP是K153的乙酰基转移酶。
图4. p300/CBP是K153的乙酰基转移酶
(图源： Wang DN, et al., PLoS Pathog. 2023)
为进一步明确K153乙酰化修饰对结肠癌细胞的影响，作者在结肠癌细胞系HCT116中构建了CDC42-WT、CDC42-K153Q（模拟K153乙酰化修饰状态）和CDC42-K153R（模拟K153未乙酰化状态）的稳定表达细胞株（图5A）。K153R的表达降低了JNK和p38的磷酸化修饰水平（图5B）,但是不影响ERK和AKT（图5C），并且沙门菌感染表达K153R的细胞株后，其p38仍有一个较低的磷酸化修饰水平（图5D）。以上结果提示CDC42 K153的乙酰化修饰对JNK和p38的磷酸化修饰很重要，尤其是p38的磷酸化修饰。作为CDC42重要的下游效应分子，PAK4参与调控JNK和p38的磷酸化修饰水平。作者发现K153R突变减弱了PAK4的激活（图5E），提示K153乙酰化修饰水平降低削弱CDC42和PAK4的结合从而导致PAK4的激活减弱。在HCT116中敲低PAK4后，JNK和p38的磷酸化修饰水平都随之降低了（图5F）,并且感染后p38的磷酸化水平依然是降低的（图5G）。以上结果说明K153的乙酰化水平与JNK和p38的磷酸化水平成正相关，而这可能是由PAK4活性介导的。
图5. K153乙酰化修饰影响JNK和p38的磷酸化修饰
(图源： Wang DN, et al., PLoS Pathog. 2023)
通过免疫印迹（图6A）和流式细胞技术（图6B和图6C）检测K153乙酰化修饰对细胞凋亡的影响，发现K153R使细胞凋亡程度减轻了，提示K153低乙酰化修饰水平可能有助于细胞抵抗凋亡发生。并且发现细菌感染（图6D，图6F和图6G）以及K153R（图6E，图6H和图6I）均可增强HCT116细胞的侵袭、迁移能力。以上结果提示K153低乙酰化修饰水平与增强结肠癌细胞迁徙、侵袭能力有关。
图6. K153的低乙酰化水平有助于增强HCT116细胞的迁移、侵袭能力
(图源： Wang DN, et al., PLoS Pathog. 2023)
为进一步验证细菌感染在CRC中的作用，作者用AOM/DSS诱导小鼠CRC模型（图7A），并感染沙门菌。在第14周收集结直肠组织样本，发现沙门菌感染的小鼠肿瘤更靠近结肠端（图7C），并通过qPCR和免疫荧光检测了肿瘤组织中的沙门菌（图7B和图7D）。与未感染组的癌组织相比，感染组的肿瘤恶性程度更高（图7E），K153的乙酰化水平更低（图7E和图7F），PAK1和PAK4的磷酸化修饰水平更高（图7G），侵袭、迁徙能力更强（图7H），并且ERK、AKT、JNK、p38的磷酸化修饰水平都增加（图7I）。以上结果提示，沙门菌感染导致的K153乙酰化修饰水平降低可能有利于CRC的发展。
图7.沙门菌感染后小鼠CRC肿瘤组织中K153乙酰化修饰水平降低
(图源： Wang DN, et al., PLoS Pathog. 2023)
为确认K153乙酰化修饰在人CRC中的表达水平，作者通过免疫组化分析17对CRC病人的肿瘤组织和邻近正常组织，发现肿瘤组织中CDC42 K153乙酰化修饰水平显著降低（图8A和图8B）。为进一步明确K153乙酰化修饰水平与不同临床分期CRC的关系，作者通过免疫组化分析了69对CRC病人肿瘤组织，发现肿瘤组织中K153乙酰化修饰水平显著低于邻近正常组织（图8C），并且肿瘤组织中K153的乙酰化修饰水平越低，CRC病人预后越差（图8D）。以上结果表明，K153低乙酰化修饰水平与CRC的发展以及病人的预后有关。
图8. K153乙酰化修饰水平低的CRC病人预后差
(图源： Wang DN, et al., PLoS Pathog. 2023)
通讯作者：姚玉峰（左），第一作者：王丹霓（右）
（照片提供：姚玉峰团队）
通讯作者简介（上下滑动阅读）
姚玉峰：上海交通大学医学院免疫所，教授，博士，博士生导师；“东方学者”特聘教授；主要从事病原菌致病机制及宿主天然免疫方面的研究，在国际知名期刊上发表论文50余篇；主持重要课题10余项，包括技部973计划、重点研发专项、传染病重大专项、国家基金委重点项目、国际合作重点项目和面上项目等。
1. Xi Y, Xu P (2021) Global colorectal cancer burden in 2020 and projections to 2040. Transl Oncol 14: 101174.
2. Zhou Y, He H, Xu H, Li Y, Li Z, et al. (2016) Association of oncogenic bacteria with colorectal cancer in South China. Oncotarget 7: 80794-80802.
3. Lu R, Wu S, Zhang YG, Xia Y, Liu X, et al. (2014) Enteric bacterial protein AvrA promotes colonic tumorigenesis and activates colonic beta-catenin signaling pathway. Oncogenesis 3: e105.
4. Nejman D, Livyatan I, Fuks G, Gavert N, Zwang Y, et al. (2020) The human tumor microbiome is composed of tumor type-specific intracellular bacteria. Science 368: 973-980.
5. Baumler AJ, Tsolis RM, Ficht TA, Adams LG (1998) Evolution of host adaptation in Salmonella enterica. Infect Immun 66: 4579-4587.
6. Mughini-Gras L, Schaapveld M, Kramers J, Mooij S, Neefjes-Borst EA, et al. (2018) Increased colon cancer risk after severe Salmonella infection. PLoS One 13: e0189721.
7. Duijster JW, Hansen JV, Franz E, Neefjes JJC, Frisch M, et al. (2021) Association between Salmonella infection and colon cancer: a nationwide registry-based cohort study. Epidemiol Infect 149: e56.