Byondis：荷兰这家ADC公司，技术平台有何特色？

图1. ADC通过不同途径杀伤癌细胞的机制概述

抗体偶联药物(Antibody-drug conjugates, ADC)是一类针对癌症的生物治疗药物，它结合了单克隆抗体(mAb)的靶向能力和细胞毒性药物(Payload，有效载荷)的抗癌能力。抗体和有效载荷通过连接子(Linker)进行连接，允许将特定药物递送至抗体靶向的癌细胞。ADC进入细胞后，连接的有效载荷被释放并杀死细胞(图1)[1]。虽然ADC旨在靶向并杀死肿瘤细胞，同时不伤害健康细胞，但第一代ADC平台存在一些局限性，导致ADC的治疗窗狭窄且对患者具有不可接受的毒性。

针对上述问题，本专题系列将总结归纳国内外知名企业应用的ADC技术平台。前几期主要介绍了Synaffix、Mersana、Thiologics、Concortis、MediLink、KELUN、DualityBio和荣昌生物及宜联/映恩/科伦博泰、Zmworks的ADC技术平台，今天将继续介绍一些公司的ADC技术：

作者：知乎_西山含黛

01 Byondis概述

Byondis^[2]，位于荷兰奈梅亨，是一家独立的私营临床阶段生物制药公司，致力于开发针对难治性癌症和自身免疫性疾病的创新精准药物。Byondis最初是仿制药公司Synthon的子公司Synthon Biopharmaceuticals，最初专注于生物仿制药，后来专注于创新生物制剂和小分子的研发。2019年将仿制药业务出售后，Synthon Biopharmaceuticals继续作为一家独立公司发展，并于2020年更名为Byondis^[3]。目前该公司的商业模式主要是开发临床概念验证(Proof-of-Concept)项目，然后寻找合作伙伴进行后期临床开发和商业化。

Byondis利用肿瘤生物学和免疫学的最新见解来寻找新的分子靶标并开发新的生物实体(New Biological Entities, NBE)和新的化学实体(New Chemical Entities, NCE)，产品管线包括ADC、mAb和小分子等。目前，该公司开发了多种专利技术--ByonZine®、ByonNative®、ByonShieLD®、ByonFoLD®、ByonBranch®--用于构建新一代ADC^[4]。

ByonZine®技术平台主要是对Duocarmazine-Linker进行优化，构建含有可裂解的DNA损伤的接头药物(Linker-Drug, LD)，通过靶向介导，实现肿瘤的清除^[5]；ByonNative®技术平台是Byondis的差异化抗体偶联平台，通过部分还原的天然二硫键生成ADC，同时去除不需要的非共轭(Nude)和过度共轭(Over-Conjugated)的副产物，能够快速生成含有目标抗体的ByonZine® ADC；ByonShieLD®技术平台主要用于位点特异性偶联，利用正交半胱氨酸活化偶联技术创建均质性的ByonZine® ADC，其疏水性有效载荷的屏蔽使ADC具有卓越治疗指数^[6]；ByonFoLD®技术平台用于构建双LD抗体偶联物平台(well defined two-in-one ADCs)，其中两种不同的有效载荷(具有协同作用)以兼容的方式与单一抗体偶联^[7]；ByonBranch®技术平台，顾名思义，利用分支Linker技术将有效载荷与抗体偶联，从而产生疏水性降低的ADC^[8]。得益于以上五种技术平台的加持，Byondis技术涵盖了从先导物发现和先导物优化到III期临床研究的所有领域。

接下来，我将详细介绍各技术平台的具体内容：

02 ByonZine®技术平台

主要涉及接头-药物vc-seco-DUBA^{[9, 10]} (图1，CC-1065类似物)及其衍生物的合成制备，以及后续用于ADC制备的工艺改进。Duocarmycin衍生物作为前药提供，仅在肿瘤中被激活(图2)^[11]，进入血液循环时半衰期很短，可减少全身毒性；与其他ADC平台相比，游离有效载荷的循环水平可以忽略不计。该类化合物与DNA的小沟(minor groove)结合，引起DNA的不可逆烷基化，破坏核酸结构，最终导致肿瘤细胞死亡^[12]；但其由于其极高的毒性，通常不会单独使用。目前，该类小分子主要是作为ADC中的细胞毒性药物使用。

图2. vc-seco-DUBA的结构式及其作用机制

vc-seco-DUBA在专利WO2011133039^[10]中需要四步合成，规模到50-100 mg，产率在21-25%，经过专利WO2019101850^[5]优化到适合工业化规模生产(产率53%~79%)。Byondis利用自身拥有的曲妥珠单抗生物类似药(Trastuzumab-anns, Kanjinti，于2012年授权给Amgen)与vc-seco-DUBA偶联构建ADC药物-SYD983^{[11, 13, 14]}，DAR约为2，与Trastuzumab相比，SYD983的HER2结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和HER2介导的内化作用相似。在体外实验中，表达HER2细胞能被SYD983有效地杀死，但SYD983在不表达HER2的细胞中没有活性。SYD983在体内可剂量依赖性地减少BT-474小鼠异种移植中的肿瘤生长。SYD983在体外人和食蟹猴血浆中稳定，但由于小鼠特异性羧酸酯酶使其在小鼠血浆中的稳定性相对较差。SYD983在食蟹猴中的给药剂量可达30 mg/kg，暴露量高，血浆中稳定性好，无严重毒性作用；食蟹猴安全性研究表明，SYD983无诱导的血小板减少症，也没有诱导外周感觉神经病变，这两种情况在含微管蛋白抑制剂的ADC试验和研究中较为常见^{[15, 16]}。

为了提高同质性，利用疏水相互作用色谱(Hydrophobic interaction chromatography, HIC)对SYD983进一步纯化，得到SYD985(图2，[vic-] trastuzumab duocarmazine)^[17]，其由约95%的DAR2和DAR4种类组成，比例约为2:1，平均DAR约为2.8^[16]。SYD985通过三种机制发挥作用(图3)^[3]，在HER2阳性转移性乳腺癌异种移植模型中显示出较高的抗肿瘤活性。SYD985结合未纯化前SYD983的有利特性和一定的均质性，被选中进行进一步开发，目前已有多项临床实验评估其治疗活性，其用于三线治疗HER2阳性转移性乳腺癌已进入Ⅲ期临床试验，用于二线治疗HER2表达的子宫浆液性癌已进入Ⅱ期临床试验(表1)^{[18, 19]}。

图3. SYD985的三种作用机制

表1. SYD985所涉及的临床试验

03 ByonShieLD®技术平台

主要用于位点特异性偶联，在抗体的合适位置引入半胱氨酸(Cys)残基可以控制偶联位点，并且获得的位点特异性、DAR值均一的ADC，该种方法构建的ADC在体内的功效、安全性和稳定性方面会得到很大改善^{[6, 20]}。基于Cys构建ADC的方法有很多种，例如大家较为熟知的是Genentech的ThioMab技术^{[21, 22]}，但这些技术或多或少都会产生半体(mAbs half-body)或杂乱的二硫键(scrambled disulfides)。

图4. 作为还原剂的苯磺酸类衍生物

Byondis基于原有的技术^[23]对抗体进行特定位置的工程化改造(引入Cys)，利用专有的苯磺酸类衍生物(图4)对抗体CH1、VH、VL和CL结构域中引入的Cys进行选择性还原，而天然半胱氨酸残基形成的链间二硫键则保持完整，该方法可以完全消除半体和杂乱二硫键抗体的形成^[6]。苯磺酸类衍生物的还原作用最早是Novo Nordisk将其用于凝血因子VⅡa中戴帽(Capped)工程化Cys的还原并进行后续的PEGylation，但其应用于单抗时可打开链间二硫键^[24]。

Byondis经过优化，利用该类苯磺酸衍生物实现了单抗的快速选择性Cys偶联。利用该技术构建的Anti-PSMA vc-seco-DUBA HC41C ADC的DAR可达1.80，其中裸抗约为1.5% (HIC)；利用SDS-PAGE检测其产物中无半体产生，较传统方法(~6%)更具优势；偶联后产物中Monomer的含量高达99% (SEC)，相较于传统方法(97.9%)具有更高的均质性。

04 ByonFoLD®技术平台

利用苯磺酸类小分子(DPPBS)选择性地还原Cys改造的抗体，将其产物重新置换Buffer，加入TCEP进行进一步还原，然后与vc-seco-DUBA和vc-MMAE在室温下孵育构建含有双LD的ADC (图5)^[7]。后一步还原过程中TCEP的用量取决于抗体的自身性质以及预期的DAR值。

图5. Dual Linker-Drug抗体偶联物的制备模式图(作者自己根据专利绘制)[7]

利用图5中的方法，专利中构建了Anti-5T4 (HC41C)-vc-seco-DUBA、Anti-5T4 (HC41C)-vc-MMAE和Anti-PSMA (HC41C)-vc-seco-DUBA，通过与HC41C NEM-capped的ADC中的裸抗含量(22.4-38.7%)进行对比，发现双LD的ADC产物中的裸抗明显下降(<2.3%)；通过调整TCEP的当量控制双LD ADC的DAR值以及两种有效载荷的占比，使两种不同的有效载荷以兼容的方式与单一抗体偶联，该方法允许构建具有协同作用双有效载荷的新一代ADC药物。

作者对于该技术的疑问在于是否可用明确的含NEM的有效载荷进行第一步偶联，明确DAR值后再将其产物进行TCEP还原，最后与另一有效载荷进行偶联，构建DAR更加明确的双LD ADC，该种偶联方式是不是对有效载荷的化学性质有一定的要求；此外，作者认为可以利用MALDI-Tof质谱检测终产物ADC的还原性产物，通过加权平均的方法计算该种ADC的明确DAR值。

05 ByonBranch®技术平台

利用分支接头(图6)将有效载荷与抗体偶联，从而产生疏水性降低的ADC^[8]。许多现有偶联技术的接头是线性接头(Endo-linkers，内接头)，即在药物和抗体或其抗原结合片段的中间Linker具有切割位点。目前，为改善ADC疏水性方法包括将水溶性基团(例如聚乙二醇聚合物)^[25]引入到Linker中，添加增溶基团必然会增加LD的复杂性，并且在大增溶基团的情况下甚至会增加缀合物制造的复杂性。

图6. 含有分支接头的有效载荷

基于以上问题，Byondis通过使用非线性接头(图6左，Exo-linkers，外接头)，无需构建(庞大的)水溶性基团即可降低ADC的疏水性。该接头中的结构排列可导致疏水性药物与抗体或抗原结合片段之间的距离更短，药物与周围的亲水水性环境隔离开来，从而使ADC的疏水性降低。该种作用与抗体中的硫原子和药物的氧原子个数有关，随着这两种原子数的降低，疏水性降低作用会增加(图6右)。

结语

Byondis整合目前拥有的专有技术，用于构建具有广阔前景的临床候选药物，旨在将患者的希望变为现实。目前，该公司除前面提及的SYD985，还有三款ADC药物：BYON3521、BYON4413和SYD1875 (表2)^{[18, 26-30]}。另外，Byondis与MacroGenics签订了第一个授权的ADC支持技术协议，从而创建了MGC018，这是一种靶向B7-H3的实体瘤的ADC，目前正在临床开发中。

表2. Byondis ADC研发管线

Byondis的目标是将其开发的新生物和化学实体(在可能的情况下独家和全球)对外许可，以供合适的(生物)制药公司进一步开发和商业化。希望Byondis能够充分利用其卓越的科学制造能力创造更多的能够战胜癌症和自身免疫性疾病的精准药物，从而改善患者的治疗效果。

 主要参考文献 

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