综述(IF:20.808) |Cell子刊：质谱流式细胞术的进展与前景

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编译：微科盟-草重木雪 ，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

质谱流式细胞术(MC)是一项最新技术，它将基于等离子体的悬浮细胞电离与飞行时间 (TOF) 质谱法相结合，以灵敏地量化金属同位素标记的亲和试剂对关键蛋白质、RNA、多肽的单细胞丰度。鉴于多重检测（每个细胞约50个）和每次实验捕获数百万个细胞的能力，MC提供了一种可靠的方法来分析与人类发育和疾病相关的罕见过渡细胞状态。本综述回顾了MC方法进展，这些方法允许研究者可以在单个实验中探索跨多种条件和样本类型的细胞调节动态。此外，本文还讨论了MC的当前限制和未来前景，以及总结了通常用于从单细胞蛋白质组数据集中获取生物学分析的计算工具。

亮点：1. 质谱流式 (MC) 催化了免疫学及其他领域的新一代单细胞蛋白质组学发现。2. 单细胞状态（即细胞周期、细胞凋亡、代谢、信号传导等）的量化提供了对细胞行为的调控见解。3. 新的算法可以组织MC数据以发现新的细胞群(即调节状态和免疫表型)，并根据分化状态将细胞组织成各种关联。4. 利用MC数据集为互补功能和分子分析研究(即基因表达和表观遗传分析)提供正交实验的机会。5. 针对不同单细胞状态的新分析方法和新分析模式（即成像）以及其他元素报告同位素为未来的发展提供了许多机会。

论文ID

原名：Revealing new biology from multiplexed, metal-isotope-tagged, single-cell readouts译名：多重金属同位素标记的单细胞分析揭示了新的生物学现象期刊：Trends in Cell BiologyIF：20.808
发表时间：2022.02通讯作者：Sean C. Bendall通讯作者单位：斯坦福大学医学院

主要内容

1. MC：对传统蛋白质组学工具的扩展
过去30年中的各种突破性发现都是对特定生物分子（如蛋白质或RNA）在一组细胞中或最近几年在单个细胞中进行准确定量的结果。跨实验条件和样品捕获感兴趣分子丰度变化的能力率先被用于推断细胞类型、信号通路、细胞对药物等扰动的反应以及疾病驱动的细胞功能失调方面。抗体是使用最广泛的蛋白质亲和试剂，它们的第一个应用是在批量检测（例如蛋白质印迹）中为感兴趣的蛋白质提供可测量的替代物。然而，足够的细胞裂解物（从0.1到200万个细胞）对于稳定检测感兴趣的蛋白质是必要的。鉴于固有的细胞间变化和低细胞数量，这种批量方法不适用于研究骨髓等人体组织。考虑到人类生物学的复杂性，研究人员需要能够以单细胞分辨率捕捉更广阔画面的工具，从而可以从根本上了解可用于新生物技术、诊断和治疗的细胞行为。随着微流体在细胞悬液中的应用，单细胞检测成为可能。结合开发更灵敏的抗体标记试剂，例如镧系金属螯合物和荧光分子，使得研究者可以在单细胞层面检测最多8个感兴趣的蛋白质。然而，由于荧光团之间的光谱渗出，这些技术同时测量多个靶点的能力有限，并且可能会受到信号伪影的影响，例如自发荧光（图1A）。相比之下，通过电感耦合等离子体(ICP)质谱法测量的金属镧系元素同位素作为分子标记引入了一种新方法，该方法直接受益于镧系元素同位素的高灵敏度和特异性，并扩大了同时捕获的检测数量（图1B）。鉴于每种金属同位素的质荷比相对一致，与荧光检测中的光谱重叠相比，镧系元素信号的重叠相对较小。此外，由于生物组织中没有重金属同位素（与流式细胞术中的自发荧光不同），因此没有内源性信号干扰，从而导致MC数据的信噪比更高。图1 荧光团偶联亲和试剂与金属同位素偶联亲和试剂的信号检测比较(A) 荧光流式细胞仪使用与荧光团分子连接的亲和试剂，使用基于光的检测来测量单个细胞中靶分子的丰度。(B) 单细胞质谱流式细胞术使用与稳定、元素纯镧系金属同位素结合的亲和试剂，使用基于质谱的元素分析来测量单个细胞中靶分子的多重丰度。简称：FITC，异硫氰酸荧光素。
这些优势，再加上稳定的镧系金属同位素聚合物螯合物与亲和试剂（即纯化的抗体或核酸探针）的化学偶联方面的进步，使得使用MC开发高通量和高度多重的单细胞蛋白质组学分析成为可能。MC将高细胞通量与TOF质谱法的灵敏度和参数化相结合，以捕获单个细胞中的相对蛋白质表达（与蛋白质印迹、ELISA或其他利用光谱限制荧光报告分子测量生物分子丰度的方法相比）。除了通量高达每秒400个细胞和每天数百万个细胞的一般细胞参数（即DNA含量、活力、细胞周期阶段）外，研究人员可以使用MC常规分析超过40种蛋白质、RNA、翻译后修饰(PTM)或其他分子靶点的靶向单细胞表达（图2A）。MC的多重参数空间和细胞吞吐量能够在一轮数据采集中探索整个细胞系统，这已在人体免疫系统中得到证明（图2A）。MC等技术的出现使我们能够设计实验以更好地了解人类生物学和特别是人类发展和体内平衡中复杂、协调的过程以及随后的疾病失调（图 2B）。我们可以在稀有细胞群中同时准确地定义多重细胞状态和功能，这与人类系统相关（图2B）。这篇综述探讨了MC加速新生物学发现和对关键生物学过程进行系统分析的不同方式，更重要的是研究人员如何应用新的实验和计算技术来更好地回答他们的生物学问题。此外，在当前多种竞争性单细胞技术的背景下，我们讨论了MC在这个不断发展的环境中的位置以及MC技术可以补充和增强其他广泛使用的检测方式。图2 质谱流式细胞仪(MC)在研究生物系统的细胞组成和行为方面的应用单细胞MC使用标有纯化金属同位素报告基因的亲和试剂来测量靶分子的多重表达。(A) 通常使用MC测量的细胞特征和MC实验的一般工作流程。(B) MC分析最适合可作为单细胞分离的生物系统，例如体外维持的细胞系或收集的原代组织。MC的应用可以单独或联合用于研究生物系统下的细胞行为。对收集的单细胞数据进行计算分析，可以识别潜在的细胞特征，例如细胞簇或细胞进展过程中的表达动态。
2. MC能够通过深入和强大的细胞谱分析发现新的细胞类型
MC 最早开发和最广泛使用的应用是分析血液或组织中的免疫细胞频率（即免疫表型分析）。这种方法在血液或组织样本中发现的数百万个免疫细胞中捕获了丰富的谱系标记（例如CD3、CD57）和功能分子。一般来说，实验设计包括从预先确定的队列中收集免疫细胞（通常是外周血或骨髓）的原发组织标本，然后用MC进行分析，以检查不同实验组中多种免疫细胞类型的相对丰度和活性。由于仅使用一小部分MC标志物即可轻松识别主要免疫亚群，研究人员可以同时评估其他表面和/或细胞内因子，这些因子可告知免疫细胞功能，例如耗竭标志物（例如，PD1、LAG3）或细胞内细胞因子水平（例如，干扰素γ、白细胞介素-15）。MC技术的免疫表型分析能力使其非常适合临床试验应用如免疫治疗，这些应用中，我们尚不了解基于嵌合抗原受体的细胞疗法或检查点阻断生物制剂的复杂作用和反应。我们需要更好地绘制患者免疫细胞状态和功能变化的图表，以改进免疫治疗靶点和/或设计联合疗法。为此，临床试验中的大型患者队列在MC上运行，并使用样本和活细胞条形码以及抗体冻干来控制实验变量（例如抗体染色）和双重污染（表1）。为了确保测量的一致性，五金属磁珠与样品的运行数据被用于在单次或多次运行中对TOF采集的不一致性进行标准化。最后，来自相邻（+1 质量）和氧化（+16 质量）金属同位素的MC数据中的信号溢出不成比例地影响低丰度标志物（例如，T细胞衰竭蛋白）并降低测量的准确性。我们特别报道了最近一些工具来补偿这些线性溢出效应，并确保在单细胞中准确的相对蛋白质定量。
表1 MC的示例条形码模式
虽然免疫表型实验主要用于外周血和骨髓，但在其他细胞系统和组织中也有类似的应用，例如中枢神经系统和肌肉。此外，分析这些复杂系统中多种相互作用的免疫细胞类型，可以量化不同细胞群和/或标志物之间的结合情况，并揭示在批量检测中被掩盖的特征。总的来说，这些研究突出了MC在捕获免疫细胞频率和功能方面的广泛用途。我们特别报道了其在其他复杂和免疫浸润组织（如淋巴器官或肠道）中的应用，以更好地了解循环和组织驻留免疫细胞之间的差异以及它们在这些隔室之间移动时的细胞状态变化。由于每个样本捕获约50个特征的高维细胞状态的细胞数量在1-1000万之间，以及在一项实验中收集的样本数量较多即每次条形码运行20-50个样本，由此产生的庞大且复杂的MC数据集需要精心设计的计算流程进行分析（图3A和表2）。通常，已知细胞类型频率的量化以及新细胞状态的发现都是此类研究的重点。为了达到这一效果，细胞聚类等计算方法可以在免疫表型和更广泛的细胞谱研究中识别被测细胞群所持有的保守状态(图3B)。当前的聚类工具允许研究人员识别保守的细胞状态并发现稀有的细胞群（即细胞状态较少），然后通过功能分析和实验进行验证（图 3B）。当将其扩展到临床环境中时，细胞聚类可以与使用独立临床特征（如治疗反应或疾病阶段）的回归分析配对，以识别诊断或治疗相关的细胞群和标志物。图3 用于质谱流式细胞术(MC)数据分析的计算技术，以寻找新的细胞亚群和复杂的生物系统的过渡(A) MC数据通常在数据框中表示，其中特征（测量的靶点分子）作为列，单个细胞作为行。(B) 嵌入由选定特征表示的高维空间中单细胞数据点，通过计算其靶点分子表达的相似性进行分组或聚类。(C)细胞从选定的多维特征空间投射到二维空间，其中二维空间布局捕获多维特征空间中数据的全局和局部结构。统一流形逼近和投影（UMAP）是一种常用的降维算法。(D) 处于异步、动态过程（例如分化）中的细胞占据不同的过渡状态，这些过渡状态可以通过分化时间建模为细胞轨迹。
传统的细胞分析主要局限于细胞表面标记的细胞类型信息。MC还可以捕获多种细胞调节信息，例如信号传导、新陈代谢、全局翻译活动、染色质含量和谱系发育。以下部分讨论了各种生物领域的关键开放性问题，这些问题正在通过MC技术的不同应用得到解答。我们还强调了MC扩展以及与正交技术的集成，从而进一步扩展了MC功能。
3. 细胞的多重信号状态揭示了瞬态和协调的信号网络活动
细胞内信号通路的活性是细胞对周围环境变化进行反应的基础。信号通路激活是一个多方面的过程，它通常始于配体与受体结合，导致下游靶点的PTM以一种严格调节的方式引发特定的细胞反应，例如T细胞受体(TCR)激活等基因表达的变化。由于细胞信号反应的固有随机性和通路的退化性，我们很难监测这一多方面的过程。因此，像MC这样能够捕获多个单细胞信号蛋白的方法可用于测量多个途径的部分反应、动力学和协同/拮抗。MC允许捕获亲和试剂，该试剂识别与各种信号通路有关的特定PTM如磷酸化、泛素、甲基化等，以探究和分析对细胞扰动的反应。TCR介入后的初级T细胞信号动力学是一种与临床相关的信号现象，且已被充分研究。MC被有效地应用于量化TCR结合的快速和协调的信号动力学。小鼠初级T细胞的信号通路活性显示幼稚和记忆亚群的通路活性一致，但幼稚T细胞的信号通路反应更强。研究人员同样可以使用相互信息度量来揭示MC数据中的通路动态和标记关系。正如一项检查人类B细胞表型和功能多样性的研究中所示，使用MC可以很容易地捕获较大群体中单个细胞的细胞信号反应的随机性。在其他免疫环境中、在共培养类器官肿瘤发生模型中甚至在细胞重编程期间，对细胞内信号传导的研究表明，使用MC检测不同生物系统中单个细胞的信号通路活性是一种常见的方法。最后，这些研究将受体信号级联与细胞谱一起捕获，说明了缩小MC应用可以研究单个细胞群中的信号通路级联或检查相互作用的细胞系统（例如外周血中的免疫细胞与组织中的免疫细胞）。
4. 使用多种学习工具探索新的细胞状态有助于理解细胞调控
除了量化信号通路活性外，MC 还可用于稳健地估计细胞生物合成活性、代谢和表观遗传状态。全局大分子生物合成和代谢途径活性可以在同一实验中由其他表型标记所描绘的细胞过程和转变中进行跟踪。考虑到细胞增殖和DNA合成受到高度调控，以确保组织祖细胞库的内稳态同时防止发育不良，评估细胞周期以及细胞周期表型的方法将能够识别细胞类型或细胞分裂改变的发育时期。嘧啶类似物 5-碘脱氧尿苷通常用于标记处于S期的细胞，这些细胞正在积极地进行DNA复制，以测量MC。此外，小分子试剂可用于估计全局RNA和蛋白质合成，从而可捕获这些生物过程在细胞周期进展为有丝分裂期间的精细全局抑制以及它们在体外激活人体免疫细胞亚群中的动态活动。最后，一种新开发的含有碲重金属原子的氨基酸类似物被证明可用于评估细胞系和小鼠中蛋白质合成活性。总的来说，这些MC方法能够并行估计细胞生物合成活性。此外，当与细胞表型分析结合使用时，它们还可以在复杂的生物环境中进行准确的细胞鉴定和潜在生物合成活动分析。除了细胞生物合成外，单细胞的代谢状态也反映了它们当前的功能以及它们对环境信号的反应能力。然而，很少有方法可以捕获单个细胞中的细胞代谢特征。文献报道了一种可检测单细胞代谢状态特别是各种条件下的人类原代T细胞的新MC方法。为此，研究者开发了一种具有限速酶抗体和主要代谢调节功能的MC模式。标记物被组织成代谢模块，例如糖酵解和氨基酸转运。为了对此进行基准测试，研究者将代谢靶点累积表达的单细胞代谢评分与金标准代谢消耗测定法进行了比较。这种新的代谢MC测定已被用于描述结肠癌中T细胞耗竭的新代谢状态，我们预计其将应用于代谢失调的其他情况。同样，最近的工作使用组蛋白标记与外周血中的谱系定义标记物一起追踪表观遗传状态及其在衰老过程中的异质性变化。值得注意的是，随着来自细胞类型定义表面蛋白的待研究标志物的扩展，抗体的验证和优化变得更加复杂。与任何基于抗体的测定一样，阴性和阳性对照对于确定标记物的特异性是不可或缺的。然而，在检测翻译后修饰的蛋白质（如磷酸化激酶或组蛋白修饰）的情况下，我们需要使用药物治疗和/或敲低来验证抗体。我们需要进行进一步的滴定，以获得最佳的染色浓度，从而达到最佳的信噪比。鉴于能够同时测量单个细胞中的众多特征，MC使研究人员能够捕获关键的细胞调控信息以及表型和其他功能标记物。然而，数据的高维性带来了独特的挑战，传统的数据可视化流式细胞仪方法（例如2D散点图）不足以表示数据分布。为了将高维单细胞数据（例如MC捕获的多重代谢或表观遗传状态）投影到低维表示中，研究者将流形学习方法应用于数据。所得到的嵌入结果保证了细胞在低维空间中的位置再现了细胞在高维空间中的位置。诸如t分布随机邻域嵌入(tSNE)和较新的统一流形逼近和投影(UMAP)等工具以及PHATE方法，使得研究人员可以研究细胞状态与系统中细胞状态的异质性之间的潜在关系，从而以无监督、数据驱动的方式进行群体研究（图3C和表2）。但是，研究人员需要记住，这些表示是用于高维数据的可视化，并不构成对数据的深度分析。通常，聚类结果被投影到嵌入或嵌入被用于跟踪计算轨迹上表型之间的细胞转换。
表2 分析MC数据的计算方法5. 单细胞轨迹可以通过感兴趣的细胞表型估计转变

动态的细胞过程如肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL)耐药性、上皮-间充质转化(EMT)和骨髓中的B细胞成熟，内在地囊括了一系列细胞状态，其中许多是暂时性的，发生频率较低。MC能够很好地捕捉这些细胞状态，它能够在短时间内检测数百万个细胞，描绘关键的细胞状态转换并量化相关的调节因子。众所周知，EMT在胚胎发育过程中非常活跃，并且在疾病/癌症进展过程中通常会重新激活。为了更好的解析EMT，研究者通过实验驱动的人肺癌细胞系中的EMT对细胞进行了分析。一个完整的EMT图谱绘制了这一过程中所经过的细胞通路，随后该图谱被用于识别原发性人类肺癌样本的EMT状态，并预测其临床结果。重要的是，这项研究证明了我们可以从模型系统中获取观察结果并将它们在主要临床样本上进行转化分析，同时该方法可以扩展到其他疾病模型上。除了追踪耐药性和疾病背景下的细胞转变外，MC还可用于在发育转变或发育重编程期间绘制蛋白质表达图，例如B细胞成熟或诱导多能重编程。研究人员可以使用上述MC方法来识别疾病诱导的细胞状态及其与其他细胞类型的关系。此外，MC通常借助轨迹推断算法，通过异步生物过程（例如癌症进展、干细胞分化和免疫细胞发育）来追踪细胞进展。在这些应用中，可展示动态表达模式的细胞特征被用于推导伪时间轨迹（图3D和表2）。使用Wanderlust轨迹推断，研究者绘制了B细胞成熟图谱，并在主要转变处确定了细胞内信号传导和生物合成活动的协调。不久之后，其他模拟分支轨迹的轨迹查找算法，如Wishbone和Monocle，被用于绘制更复杂的细胞轨迹和分化中的分支点。较新的算法方法，如基于分区的图抽象(PAGA)，试图通过聚类来捕获离散的细胞状态，并通过使用单细胞聚类数据的图抽象揭示这些状态之间的联系，从而捕获连续的细胞转换。一般来说，以单细胞 RNA-seq(scRNA-seq) 为基准的轨迹算法可以应用于 MC 数据集。然而，鉴于两种数据类型之间的数据结构存在显著差异（scRNA-seq 中的高维和数据稀疏性），对于MC数据，我们可以省略标准处理步骤，例如scRNA-seq的主成分分析(PCA)。MC能够测量系统中或跨条件的一些多重细胞状态，并与根据高维相似性对细胞进行排序的计算工具配对，使研究人员能够在人类生物学的不同领域提出特定的和相关的问题。我们预计未来会在其他器官发育/失调和病毒性疾病发作的背景下进行研究，例如早期神经发育和神经退行性变、其他自身免疫性疾病（例如类风湿性关节炎）以及追踪冠状病毒感染(COVID)和其他急性病毒感染中的免疫重塑。

目前的局限

镧系金属亲和试剂标记的一个关键限制是不能进一步的多重测量特征。研究者已经开发了一次标记多种金属的方法，可在MC上应用多肽MHC四聚体染色，但很难将其应用于抗体标记。由于这种限制，其他允许超过1重条形码的标记方法，例如亲和试剂的 DNA 寡核苷酸标记，可以测量每个细胞的50多个特征。利用寡条形码的多组学技术的进一步发展，我们可以一次捕获来自多个调控层的信息。然而，尽管它们具有更高的多重和多组学能力，但这些技术并没有淘汰掉MC技术。由于这些技术使用通过单细胞测序测量的标签，因此灵敏度较低，导致检测存在限制（低丰度蛋白质-例如转录因子-不易检测），每次实验可以捕获的细胞数量较少（数万 vs 数百万个细胞），并且成本和复杂性极高，不适用于大型临床研究。单细胞测序检测也具有更高的数据稀疏性，因此信噪比和相对蛋白质丰度的准确性更低。其他考虑因素包括需要对寡标记抗体染色进行更严格的优化，因为与MC相比，非特异性和非结合信号更高。综合这些发现，尽管寡核苷酸标记的亲和试剂测量可用于大型的“钩钓考察”类型的研究，在这些研究中，特征的大小告知了所测试的生物系统的模式。当研究者对生物过程具有先验知识时，许多其他基于假设或探索性的研究更适合选择更多“监督”和更容易操作的实验技术，如MC和流式细胞术。MC 的另一个限制是样品无法回收，因为我们需要将细胞电离以检测每个细胞的抗体偶联重同位素丰度。这与流式细胞术和荧光激活细胞分选分析不同，后者可以对分选的细胞进行下游分析。此外，与MC相比，当前的高参数流式细胞仪（例如 BD FACSymphony）具有相似的单细胞多重分析能力（每个细胞最多50个读数）和更高的细胞通量（在高速细胞分析仪中约为40 000）。但是，两个平台中读出的动态范围和灵敏度之间存在显著差异。某些荧光团比金属同位素具有更高的灵敏度和动态范围，可以更准确地捕获低丰度的蛋白质。然而，与金属同位素相比，荧光团的灵敏度变化要大得多（12-15倍），这使得MC测量在标记间更加稳定可靠。个体细胞的行为和功能是生物体范围内稳态的基础，并且在疾病中失调。单细胞MC为研究大型细胞系统中细胞的鉴定和活动提供了一个平台，这在以前需要纯化（即分类）、扰动（即化学同步）或概括（即批量分析）来研究潜在的生物学。这种优势是通过使用亲和试剂（例如纯化的抗体、RNA 探针）识别细胞状态的能力提供的，这些试剂可用于常规测量细胞生物标志物的表达。随着研究者持续探索识别人类健康和疾病的新生物标志物，它们与MC方法的整合可以揭示它们对跨细胞转变或稀有细胞群的潜在生物学的贡献。此外，MC 通过常规对外周血和分离组织等样本进行的筛选实验实现了生物标志物的发现。这可以进一步扩展到用于模拟人类疾病的体外培养的类器官，在许多情况下，这比小鼠模型更能概括人类生物学。尽管这篇综述单独讨论了MC应用，但必须强调的是，我们可以通过正交、互补的实验来跟进MC数据分析，以产生额外的全新结果，包括 InTAC-seq、RNA-seq 和 BCR/TCR-seq。MC识别的重要细胞状态和群体也可以使用荧光激活细胞分选进行前瞻性分离，并作为下游功能测定的输入。这将MC的效用从系统生物学实验工具扩展到与其他技术集成的方法，以分析关键生物过程的机制。此外，在MC平台上使用具有金属同位素标记的抗体和探针组可以扩展到使用激光烧蚀和TOF质谱法来揭示人体组织中关键标志物的空间模式的成像技术中。即，成像MC和多路离子束成像(MIBI-TOF)已被用于揭示乳腺癌的空间结构以及延伸到MC的结肠癌代谢状态的空间共定位。我们还可以进一步开发MC技术和应用的一些关键方面，以实现更强大和更容易操作的单细胞测量。虽然有100多种非生物元素同位素，但我们目前仅使用大约50种用于MC上的多重分析。我们相信可以设计新的化学物质以利用更多的元素同位素进行抗体偶联。同时，大规模并行靶向和从头非靶向蛋白质组学方法在分辨率（即每个样品数百个细胞）和通量方面正在提高，并且在不久的将来可能在研究分析实用性方面超过MC。然而，在临床方面，低参数流式细胞仪仍被常规用于造血诊断。随着试剂易用性和标准化的提高，我们相信MC可以应用于临床，并为更准确的诊断提供深入的信息。

结论

总之，这篇综述强调了MC作为一种强大工具的效用能力，它可以在实验环境和人体组织中（即血液、结肠、肌肉、骨骼）以不同的调节水平（即信号传导、代谢、生物合成、转录因子表达等）分析细胞状态。与单细胞分析工具相结合，MC提供了一个框架来了解复杂生物系统和过程的基础生物学。研究人员可以有效地使用该技术平台与各种互补技术相结合，解决多个领域的关键生物学问题。原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35181197/

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