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编译：微科盟-草重木雪，编辑：微科盟Emma、江舜尧。
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导读
糖尿病性心肌病（DCM）是糖尿病最严重的并发症之一。最近的心脏病研究表明精胺（SP）具有心脏保护作用。在此，我们使用蛋白质组学和代谢组学分析揭示了精胺处理的II型糖尿病（T2D）小鼠模型的潜在靶点。我们切除并分析9只小鼠（对照组3只；T2D组3只，T2D+SP组3只）的左心室组织。我们分别使用4D无标签技术和非靶向代谢组学对全部蛋白质组和代谢组进行定量分析，并使用差异表达蛋白（DEPs）和代谢物进行生物信息学分析。T2D/对照组共鉴定出169个DEPs，包括115个上调蛋白和54个下调蛋白。此外，我们在T2D+SP/T2D组中发现了16个DEPs，且这些DEPs在细胞、代谢过程、生物调节、刺激反应和免疫系统过程中高度富集。蛋白质组学和代谢组学的关联分析结果表明，SP通过调节T2D+SP/T2D组16个DEPs的表达。我们还发现PRKG1与db/db和SP处理小鼠之间10种重叠代谢物的表达密切相关。我们的研究结果为DCM的潜在机制提供了见解，并提示了利用精胺预防DCM相关心脏功能恶化的潜在适用性。
论文ID
原名：Proteomic and metabolomic analyses reveal the novel targets of spermine for
alleviating diabetic cardiomyopathy in type II diabetic mice译名：蛋白质组学和代谢组学分析揭示了精胺在缓解II型糖尿病小鼠糖尿病心肌病方面的新靶点期刊：Frontiers in Cardiovascular
MedicineIF：5.846发表时间：2022.10通讯作者：袁辉通讯作者单位：牡丹江医学院
实验设计
实验结果
1. SP可改善db/db小鼠的心功能
为了更好地观察SP的作用，我们选择8周龄的野生型小鼠和db/db小鼠作为研究对象，每隔一天腹腔注射SP，持续12周。我们在第12周检查了血糖水平、葡萄糖不耐受、胰岛素水平、甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平，这概括了II型糖尿病的特征。结果显示，与对照组相比，T2D组各时间点的血糖水平和糖耐量均较高。虽然我们观察到胰岛素水平显著升高，但T2D组的TG和TC测量值明显升高。有趣的是，与T2D组相比，T2D+SP组的上述指标没有差异（图1A–E）。表1 T2D+SP组与T2D组差异表达蛋白
为了确定SP是否改善db/db小鼠的心功能，我们进行了超声心动图检查。与对照组相比，我们观察到T2D组射血分数（EF）和左心室缩短分数（FS）均降低，左心室收缩期末径（LVIDs）和左心室舒张期末径（LVIDd）增加。与T2D组相比，T2D+SP组出现了相反的变化（图1F–J）。
图1 SP改善T2D小鼠模型的心脏功能选择Db/Db小鼠作为T2D模型的研究对象，并在第12周测定相关指标。(A)血糖浓度，(B)胰岛素抵抗试验，(C)血清胰岛素浓度，(D)三酰甘油，(E)总胆固醇，(F)超声心动图，(G)左心室射血分数，(H)左心室短轴缩短率，(I)左心室内径收缩期，(J)左心室内径舒张期。与对照组相比，*P < 0.05；与T2D组相比，#P < 0.05。
2. SP可减轻T2D动物模型的心肌损伤和胶原沉积
为了证实糖尿病性心肌病会导致严重的心脏损伤，我们检测了收集的小鼠心肌组织的形态学变化。HE染色显示db/db小鼠心肌细胞呈现紊乱和肥大的形态，TEM进一步显示心肌肌丝溶解和线粒体水肿，SP可减轻这些变化（图2A）。血清心肌损伤标志物检测显示，T2D组血清CK-MB、cTnI和LDH含量明显高于对照组。与T2D组相比，T2D+SP组血清中上述酶的含量显著降低。结果提示SP对高糖所致心肌损伤具有保护作用（图2B-D）。表2 T2D+SP组和T2D组之间的差异代谢产物
Masson和天狼星红染色结果显示，与对照组相比，T2D组胶原沉积量更大。第12周db/db小鼠的体重（BW）和心脏重量与胫骨长度之比（HW/TL）高于野生型小鼠。与T2D组相比，SP逆转了除BW外的这些变化（图2E–H）。
图2 SP通过保护心肌组织和减少胶原沉积改善糖尿病心肌病(A)苏木素-伊红染色和透射电镜代表性图像，(B)血清CK-MB浓度，(C)血清cTnI浓度，(D)血清乳酸脱氢酶浓度，(E)心脏组织横断面切片的代表性天狼星红染色和Masson三色染色，(F)心脏组织纤维化面积统计，(G)体重，(H)心脏重量/胫骨长度比。与对照组相比，*P < 0.05；与T2D组相比，#P < 0.05。
3. 心脏组织中差异表达蛋白的鉴定和聚类分析
我们对指定组的心脏组织进行质谱分析，共获得989675个二级光谱图。有效谱图的数量为449571，谱图的利用率为45.4%。通过光谱分析，我们共鉴定出34106个肽，其中32977个是特异性肽片段。我们共鉴定出3588种蛋白质，其中3071种是可定量的，大多数蛋白质分子量为20–60 kDa（图3A、B）。采用详细的热图绘制方法，我们利用层次聚类算法对DEPs进行分析，不同颜色代表DEPs在热图中的表达水平。与对照组相比，T2D组的大量蛋白质表达发生了变化（图3C，D）。T2D/对照组共鉴定出169个DEPs，包括115个上调蛋白和54个下调蛋白。此外，我们在T2D+SP/T2D组中评估了16个DEPs，火山图总结了这些结果（图3E、F、表1）。
图3 使用质谱法鉴定差异表达蛋白（DEPs）(A)检测肽和蛋白的柱状图，(B)检测肽和蛋白的分布，(C)小鼠心脏组织DEPs的热图，(D)蛋白质组学数据的PCA，点代表不同的样本，(E)火山图显示C57BL/6小鼠和db/db小鼠心脏组织中蛋白质的定量表达，用颜色标记倍数变化>1.5的DEPs，(F)火山图显示T2D组和T2D+SP组心肌组织蛋白定量表达，倍数变化>1.5的DEPs用彩色标记。
4. DEPs功能富集分析
我们基于基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）参考数据库对DEPs进行功能富集分析。值得注意的是，T2D/对照组和T2D+SP/T2D组的DEPs分别在几个相关GO术语中显著富集，包括代谢过程、生物调节、发育过程、免疫系统过程和转运蛋白活性（图4A、B）。T2D组和对照组之间的DEPs在多个KEGG途径中富集。具体而言，几种代谢相关途径得到富集，如脂肪酸降解（mmu00071）、丁酸代谢（mmu00650）、过氧化物酶体（mmu04146）、铁死亡（mmu004216）、PPAR信号通路（mmu03320）和不饱和脂肪酸生物合成（mmu01040）。此外，MAPK信号通路丰富，与该通路相关的大部分DEPs下调（图4C，D）。
图4 对差异表达蛋白(DEPs)进行基因本体(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析（A）对照组和T2D组之间DEP的GO富集分析，（B）T2D组和T2D+SP组之间DEPs的GO富集分析，（C）气泡图表示了上调的DEPs富集的前16个KEGG途径，和（D）气泡图，表示下调的DEPs富集的前20个KEGG途径。
5. 对WT小鼠和db/db小鼠心脏组织蛋白表达进行聚类分析
为了进一步研究T2D小鼠中的差异蛋白表达，我们对db/db和WT小鼠组进行了分层聚类分析，并根据倍数变化程度将DEPs分为四个区域（图5A）。GO聚类分析的DEPs显示，一些显著上调的DEPs在过氧化物酶体功能、甘油三酯、脂肪酸和脂质的合成和代谢方面富集（图5B–D）。共同富集的通路在功能KEGG富集簇图像中显示(图5E)，与WT小鼠相比，db/db小鼠中富集了缝隙连接、铁死亡以及JAK-STAT和MAPK信号通路。在蛋白质结构域聚类分析中，一些明显上调的DEPs富含主要脂蛋白/胞质脂肪酸蛋白、烯醇CoA水合酶/异构酶家族和Sushi结构域（图5F）。
图5 WT和db/db小鼠心脏组织中DEPs的分层聚类分析（A）根据倍数变化的程度（FC），从Q1到Q4，DEP被分为四组（Q表示db/db小鼠组与C57BL/6小鼠组的比值，Q1<0.5，Q2=0.5-0.667，Q3=1.5-2，Q4>2），（B）细胞成分，（C）分子功能，（D）生物过程，（E）《京都基因和基因组路径百科全书》，以及（F）蛋白质结构域。红色表示富集程度更强。蓝色表示富集度较弱。
6. 蛋白质组学与代谢组学的相关性分析
通过对各组DEPs的数据分析，我们在T2D+SP/T2D组和T2D/对照组中仅发现1个（PRKG1）DEP（图6）。代谢组学分析结果显示，SP可以调节db/db小鼠中的51种不同代谢物，其中发现T2D+SP/T2D组和T2D/对照组之间有10种不同代谢物重叠（图6B，表2）。进一步的相关性分析表明，PRKG1可以调节10种差异代谢组（图6C，D）。此外，免疫印迹结果证明，PRKG1在T2D组表达上调，在T2D+SP组表达下调（图7A）。随后，我们检测了T2D+SP/T2D组中6个DEPs的表达。与对照组相比，T2D组Pltp和Pir的表达下调，而Thbs1、Tmem70、Hacd2和Ppm1k的表达上调。与T2D组相比，T2D+SP组的趋势相反（图7B）。
图6 蛋白质组学和代谢组学的相关性分析揭示了SP在DCM中的作用（A）维恩图显示了在T2D/对照组和T2D+SP/T2D组中差异表达的一个重叠蛋白。（B）维恩图显示了在T2D/对照组和T2D+SP/T2D组中差异表达的10种重叠代谢物。（C）热图显示了用SP处理的db/db小鼠中DEPs和差异代谢物的调节关系。（D）SP处理的db/db小鼠的蛋白质-代谢物相关网络分析。
图7 db/db和SP处理小鼠之间DEPs的免疫印迹分析（A）免疫印迹检测PRKG1蛋白表达水平。（B）免疫印迹检测Pltp、Pir、Thbs1、Tmem70、Hacd2和Ppm1k的蛋白表达水平。*与对照组相比，P<0.05；#与T2D组相比，P<0.05（n=8）。
讨论
糖尿病（DM）是一种代谢性疾病，通常分为I型和II型。前者约占所有糖尿病病例的10%，通常由先天性胰岛功能障碍引起，而更常见的II型（90%）主要由胰岛素抵抗引起。根据临床研究统计，II型糖尿病的心血管疾病发病率比I型糖尿病高得多。因此，研究II型糖尿病心肌病的发病机制和治疗策略至关重要。在本研究中，我们选择了一种II型糖尿病模型db/db小鼠作为研究对象，其遗传背景是C57BL/6小鼠糖尿病基因敲除，甚至胰岛素干预也无法控制高血糖。因此，db/db小鼠被广泛用于研究内分泌缺陷、神经系统疾病以及由糖和脂代谢异常引起的心脏疾病。在1、4、8和12周时，db/db小鼠表现出持续的高血糖，SP注射后没有下降趋势。在第12周，T2D组的胰岛素活性、血清TC和TG水平显著升高。结果与胰岛素抵抗试验的趋势一致，这表明成功建立了II型糖尿病小鼠模型。然而，SP对上述指标没有影响。建模12周后，超声心动图显示T2D组EF和FS降低，LVID和LVIDd增加，表明心脏收缩功能障碍。进一步的心肌损伤标志物酶试验证实血清中LDH、CK-MB和cTnI水平升高，SP可减弱上述心脏损伤指标。在T2D组和T2D+SP组中，db/db小鼠体重显著增加；SP处理可降低HW/TL比值。我们怀疑这种变化是由于心脏重塑以及心肌细胞外基质的增加。心脏形态学支持这一推测。T2D组心脏重量增加，Masson和天狼星红染色显示间质区有大量胶原沉积，TEM结果显示明显的肌丝溶解和线粒体水肿，HE结果显示db/db小鼠心脏发生变性和心肌细胞坏死。在我们的研究中，SP可以有效地抑制上述变化。为了进一步评估SP对T2D小鼠的影响，我们进行了相关的组学研究，以发现潜在的分子调控机制。为了探索SP治疗的T2D小鼠的特征，我们使用4D无标签技术全面分析各组的特征和差异。我们在db/db和C57BL/6小鼠之间鉴定了169个DEPs，在用SP处理的T2D组中仅鉴定了16个DEPs。这表明心脏是一个相对稳定的器官，具有相对稳定的蛋白质表达。为了进一步阐明SP对心脏的保护机制，我们对T2D/对照组的DEPs进行GO分析，发现BP类别中鉴定的大多数蛋白质与细胞过程、代谢过程和生物调节密切相关，而脂质和脂肪酸代谢过程参与最多。我们还将DEPs置于KEGG通路。结果表明，这些注释的分化蛋白主要与PPAR信号通路、过氧化物酶体、缝隙连接、铁死亡通路和MAPK信号通路有关。通过上述数据分析，我们发现差异蛋白与脂质代谢和氨基酸代谢有关；因此，我们进行了以下代谢组学分析。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一门新兴学科，是一种系统的研究方法。它定量分析生物体内的所有代谢物，找出代谢物与生理和病理变化之间的相对关系。我们使用非靶向代谢组学技术评估各组在C57BL/6小鼠、db/db小鼠和用SP处理的db/db鼠中差异表达的心脏组织代谢物。T2D/对照组和T2D+SP/T2D组分别鉴定出205和51种差异代谢物。其中，两组之间鉴定出10种重叠的分化代谢物。这些代谢产物属于黄酮类、氨基酸、磷酸果糖、甘油脂和酰胺类，与糖尿病引起的心血管疾病密切相关。更有趣的是，SP处理可以逆转这些代谢物的表达趋势。在我们的研究中，蛋白质组学显示PRKG1是T2D/对照组和T2D+SP/T2D组中唯一差异表达的蛋白。我们在db/db小鼠的心脏组织中发现PRKG1的表达显著上调，SP处理可显著抑制其表达。免疫印迹分析进一步证实了上述变化。此外，通过蛋白质组学和代谢组学关联分析，我们发现PRKG1与T2D/对照组和T2D+SP/T2D组之间10种重叠代谢物的表达密切相关。现有研究数据表明，PRKG1（cGMP依赖性蛋白激酶-1）是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，参与一氧化氮/cGMP信号通路的传导，具有松弛平滑肌、抑制血小板聚集和调节细胞生长的功能。最近的研究数据证明，PRKG1可以调节心血管系统、内分泌系统和神经系统。上述研究表明，PRKG1在DCM的发生和发展中起着关键作用。我们使用基于蛋白质组学的数据独立采集来进一步分析T2D+SP/T2D组中的DEPs。我们注意到六种与心血管疾病密切相关的DEPs（Pltp、Pir、Thbs1、Tmem70、Hacd2和Ppm1k）要么显著下调，要么显著上调。Pltp（磷脂转移蛋白）是一种单体蛋白，属于脂质转移/脂多糖结合蛋白家族，涉及脂蛋白代谢、心血管疾病和动脉粥样硬化，以及肥胖和胰岛素抵抗。Pir (Pirin)是NF-κB的铁依赖性氧化还原调节因子，可调控真核细胞自噬依赖性铁死亡过程。Thbs1 (thrombospontin-1)已被证实过表达可导致致死性心肌萎缩。跨膜蛋白70 (Tmem70)是一种线粒体蛋白，位于线粒体内膜，与脑心肌病的ATP合成密切相关。3-羟基酰辅酶A脱水酶2（Hacd2）是HACD家族的成员，已在肥胖和代谢性疾病中进行了研究。此外，最近的研究证实，蛋白磷酸酶1K（Ppm1k）可以提高心血管疾病的风险。此后，我们通过免疫印迹验证上述6个DEPs的表达，结果与组学结果一致。虽然我们的研究筛选出了许多与DCM发病机制密切相关的分化蛋白，但它们的具体作用需要在未来的实验中逐一进一步探索。
结论
总的来说，我们的蛋白质组学和代谢组学数据表明，SP可能在II型DCM处理过程中发挥重要作用。我们的结果验证了潜在的研究候选蛋白，如PRKG1、Pltp、Pir、Thbs1、Tmem70、Hacd2和Ppm1k，它们可作为进一步评估的治疗靶点。此外，我们的研究结果可以作为未来DCM治疗策略的潜在信息来源。
原文链接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcvm.2022.1022861/full
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