科研 |华中农业：基于SWATH-MS定量蛋白质组学分析揭示马铃薯晚疫病菌PAMP诱导免疫反应的新型蛋白（国人佳作）

 点击蓝字“蛋白质组”,轻松关注不迷路

生科云网址：https://www.bioincloud.tech/

---

编译：微科盟-王丰丰，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

马铃薯是世界上最重要的非粮食物，在农业生产中占据重要地位，然而由疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的晚疫病严重威胁着马铃薯的生产。病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）在进化上相对保守，由PAMP诱导免疫反应（PAMP-triggered immunity，PTI）可以为马铃薯提供更为持久的晚疫病抗性。然而，由于已鉴定的蛋白质数量较少，目前对PTI在蛋白质水平上对卵菌病原菌的调节机制的了解非常局限。因此，本研究利用SWATH-MS（sequential windowed acquisition of all theoretical mass spectra，按顺序窗口采集所有理论质谱）技术检测了晚疫病菌PAMP诱导后的本氏烟草叶片的蛋白质组变化，该技术提供了蛋白质丰度的定量和PTI相关蛋白质的大规模鉴定。总共鉴定到4401个蛋白，与0 h鉴定到的蛋白表达量相比，有1429个蛋白在8 h、12 h、24 h、48 h四个时间点中至少一个时间点受PAMP诱导差异表达。接着，进一步对差异蛋白进行聚类分析和GO功能注释。最后，通过功能验证发现，19个候选蛋白中的6个新型DEPs被证明参与了PTI反应，包括MPT3、VAMP714、LysoPL2、APX1、HSP70-2和FKBP15-1。综上，时间进程分析和由此产生的大规模蛋白质组学分析扩大了我们对PTI机制的理解，并为发现参与马铃薯晚疫病抗性反应中的复杂蛋白质网络提供了宝贵的资源。

论文ID

原名：SWATH-MS based quantitative proteomics analysis reveals novel proteins involved in PAMP triggered immunity against potato late blight pathogen Phytophthora infestans译名：基于SWATH-MS定量蛋白质组学分析揭示马铃薯晚疫病菌PAMP诱导免疫反应的新型蛋白期刊：Frontiers in Plant ScienceIF：6.627发表时间：2022.11通讯作者：杜鹃通讯作者单位：华中农业大学

实验设计

实验结果

 1. 晚疫病菌培养滤液在48 h内诱导本氏烟草的细胞坏死

为了检测晚疫病菌培养滤液（CF）触发的PAMP免疫反应，将其和阴性对照培养液（CM）分别注射到同一本氏烟叶片上。然后观察叶片表型变化，并在0 h（CF注射后立即取样）、8、12、24和48 hpi（hour post infection，感染持续小时）分别取样用于后续SWATH-MS分析。在自然光下，在注射CF 0、8、12和24 hpi处未观察到明显的叶片表型变化，而在48 hpi下，注射CF的部位产生了明显的细胞坏死反应，而注射CM的部位无任何明显表型变化（图1A）。有趣的是，在紫外光下，早在24 hpi时，注射CF的部位就能观察到很少的细胞坏死反应，而CM注射部位则没有观察到（图1A）。然后，采用qPCR分析在0、8、12、24和48 hpi处采集的样品中3个PTI标记基因WRKY8、PTI5和ACRE31的表达。CF浸润8 h后3个基因的表达均显著上调，但在48 hpi时表达差异较大，8 hpi后，WRKY8的表达保持稳定直至48 hpi，而PTI5和ACRE31的表达分别在12和24 hpi达到峰值后下降（图1B）。

图1. 晚疫病菌培养滤液（CF）诱导本氏烟草PAMP触发免疫反应（A）CF注射在中静脉左侧白线圈内，而阴性对照（CM）注射在右侧白线圈内。（B）CF诱导的PTI标记基因WRKY8、PTI5和ACRE31的上调。重复三次独立实验，结果相似。使用学生t检验进行统计分析。误差棒代表SEM（三次独立实验的标准差），ns表示不显著，^*表示差异显著（P<0.05），^**表示差异极显著（P<0.01）。

2. CF诱导的本氏烟草中共鉴定4401个蛋白

为了鉴定CF诱导本氏烟草中的新型差异表达蛋白（differentially expressed proteins，DEPs），对CF分别诱导0、8、12、24和48 h后的本氏烟草叶片进行后续的SWATH-MS分析（图2）。利用NanoLC和SWATH方法分别对实验组（8 h、12 h、24 h 和48 h）和对照组（0 h）肽段样品进行SWATH数据的采集，每个时间点设置3个生物学重复，每一个样本采集3次SWATH数据，以检查样品的均一性及仪器的状态。实验结果显示，每个时间点获得9个数据集。利用5个时间点的所有数据，使用数据依赖性采集（DDA）模式生成一个共包含38683个唯一肽段，对应5714个蛋白的参考数据库，其中错误发生率（FDR）小于1%。将45个DIA（data independent acquisition，数据非依赖性采集模式）数据在SWATH 2.0软件中根据保留时间、前体离子质量、碎片离子质荷比等重要信息在参考数据库中进行SWATH蛋白的定性分析。总共获得4401个蛋白，在每个样品中都有出现。

图2. 晚疫病菌PAMP诱导免疫反应的新型差异表达蛋白的研究策略将本氏烟叶用晚疫病菌培养滤液（CF）浸润，然后在0（浸润后立即取样）、8、12、24和48 hpi后分别取样。从5个时间点采集的样品中提取蛋白质，并通过胰蛋白酶消化用于SWATH-MS分析。首先将采集的肽段合并后使用数据依赖性采集（DDA）模式进行数据分析生成参考数据库。同时，还通过数据非依赖性采集（DIA）模式分析了五个时间点中每个时间点采集的肽段，以获得SWATH原始数据，并将其与参考数据库库比对，得到CF诱导的蛋白质。将CF诱导8、12、24和48 hpi时蛋白表达数据与0 hpi时蛋白表达数据进行ANOVA方差分析（P≤0.05）和邓肯HSD多重比较分析，将其中P值＜0.05且差异倍数为1.5的蛋白定义为差异表达蛋白（DEPs），并对DEPs进行蛋白表达聚类分析和GO功能富集分析，筛选与植物免疫相关的候选蛋白。最后，通过病毒诱导基因沉默（VIGS）和活性氧（ROS）对其进行功能验证。

3. CF诱导的本氏烟草中共鉴定到1429个DEPs

通过R包“FactoMineR”对SWATH-MS鉴定到的蛋白数据进行主成分分析（PCA），以5个时间点样品中鉴定的4401个蛋白的检测值作为观测值，不同时间点的样本及其生物学重复为变量。结果见图3A，每个点代表一个样本，不同时间点的样本有明显分离趋势，随着时间的推移，CF诱导不同时间点后的样品在第一主成分上有明显的分组，并且5组样品组间差异明显大于组内之间的差异。由此可见，CF诱导本氏烟叶后，不同防御阶段在蛋白水平上有着显著变化。在上述鉴定到的4401个蛋白中，我们将后四个时间点鉴定到的蛋白与0 hpi鉴定到的蛋白进行了统计分析，以差异倍数为1.5且P值＜0.05为标准，共筛选出1429个DEPs（表S1）。具体来说，在8 hpi时间点筛选的331个DEPs中有129个表达上调，202个表达下调；在12 hpi时间点筛选的837个DEPs中有343个表达上调，494个表达下调；在24 hpi时间点筛选的944个DEPs中有515个表达上调，429个表达下调；在48 hpi时间点筛选的1193个DEPs中有731个表达上调，462个表达下调（图3B）。

图3. 共确定了1429个DEPs（A）主成分分析（PCA）得分图显示，CF诱导5个时间点（0、8、12、24、48 hpi）的蛋白在两个主成分上有明显分离趋势。（B）DEPs在8、12、24、48 hpi时的表达与在0 hpi时的表达不同。

4. 在聚类群7中鉴定到与防御相关的术语

为了更清晰地反映这些蛋白的表达变化情况，采用Mfuzz算法（模糊c均值聚类）对1429个DEPs的蛋白质表达谱进行聚类分析，主要绘制了9种时间序列模式，通常表现出四种表达趋势（图4A）。第一个趋势是总体下调，显示在聚类群1、2、3和8中，第二个趋势是总体上调，显示在聚类群4、6和7中。第三个趋势是在0-12 h迅速下调表达后回升，仅在聚类群5中。第四个趋势是在聚类群9中的蛋白上调表达至12 h后有所下调。在上调的聚类群中，聚类群7的趋势保持了最好的连续性，这可能与PTI防御更相关。为了进一步分析聚类群7中DEPs的功能，我们对其进行了GO功能富集分析（图4B）。在第3级生物学过程分类的前15个GO术语中，鉴定到胁迫响应（response to stress）、参与免疫反应（immune response）和生物刺激的响应（response to biotic stimulus）等与防御相关的术语，这些蛋白可能在晚疫病菌PAMP诱导抗性中具有重要作用。有趣的是，在聚类群7中也发现了一些众所周知的PTI相关蛋白质，如SGT1（Suppressor of G2 allele of skp1，一种保守的真核蛋白）和BAK1（bcl-2同源拮抗剂杀手蛋白）。这表明更多的PTI相关蛋白可能参与聚类群7中，因为它们具有相似的表达模式。

图4. 1429个差异表达蛋白（DEPs）的聚类分析和GO功能注释（A）已鉴定的1429个DEPs的蛋白质表达谱主要聚类为9种时间模式。（B）对聚类群7中的DEPs进行了GO功能注释，其中列出了属于3级生物学过程的前15个GO术语。

5. 六个新的候选DEPs被确定参与PTI反应

为了验证上述假设，我们选择了19个“胁迫响应”的DEPs，通过VIGS（virus induced gene silencing，病毒诱导的基因沉默）和ROS（reactive oxygen species，活性氧）技术对其进行功能验证，包括线粒体磷酸载体蛋白3（mitochondrial phosphate carrier protein 3，MPT3）、蛋白质二硫键异构酶类蛋白2（protein disulfide-isomerase like 2，PDIL2）、葡萄糖氧化酶3（peroxisomal (S)-2-hydroxy-acid oxidase 3，GOX3）、富含半胱氨酸的类受体激酶2（cysteine-rich receptor-like kinase 2，CRK2）、硫氧还蛋白还原酶2（thioredoxin reductase 2，NTRA）、热休克蛋白70结合蛋白2（heat shock 70 kDa protein BIP2，HSP70-12）、分子伴侣蛋白DnaJ 2（chaperone protein dnaJ 2，DJA2）、同源钙连蛋白1（calnexin homolog 1，CNX1）、溶血磷脂酶2（lysophospholipase 2，LysoPL2）、PLAT结构域包含蛋白1（PLAT domain-containing protein 1，PLAT1）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase 1，APX1）、2羟基植烷酸辅酶A裂解酶（2 hydroxypanthyl CoA lyase，HPCL）、ABCG转运蛋白40（ABC transporter G family member 40，ABCG40）、酸性内切几丁质酶（acidic endochitinase，CHIA）、脱水早期响应蛋白9（early responsive to dehydration 9，ERD9）、肽基脯氨酸顺反异构酶FKBP15-1（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP15-1，FKBP15-1）、囊泡相关膜蛋白714（vesicle-associated membrane protein 714，VAMP714）、热休克70蛋白-2（heat shock 70 kDa protein 2，HSP70-2）、核小体组装蛋白1;3（nucleosome assembly protein 1;3，NAP1;3）（表1）。

表1 聚类群7中的19个候选蛋白的详细信息

对于VIGS，以本氏烟草的cDNA为模板进行PCR扩增，从19个候选基因中扩增了约300 bp的PCR片段。用TRV（Tobacco rattle virus，烟草脆裂病毒）候选基因和对照TRV-GFP分别处理四叶期植物的叶子。三周后，从本氏烟草的不同植株中切除每个候选基因的三片叶子，并测量由flg22（Flagellum 22，22个氨基酸组成的细菌鞭毛蛋白）诱导的ROS爆发反应强度，作为判断该候选基因是否参与免疫反应通路的依据之一。与对照组TRV-GFP相比，用六个TRV候选基因处理植物后，ROS的反应发生了显著改变。候选基因MPT3的VIGS后，ROS反应显著上调，而其他五个候选基因包括VAMP714、LysoPL2、APX1、HSP70-2和FKBP15-1的VIGS后，ROS反应显著下调（图5）。通过qRT-PCR检测其沉默效率，结果显示3个候选基因的转录水平降低至50%以下（图5）。

图5. 六种新的候选DEPs参与PTI反应在病毒诱导的MPT3（A）基因沉默（VIGS）后，ROS反应显著上调；而在VAMP714（B）、LysoPL2（C）、APX1（D）、HSP70-2（E）和FKBP15-1（F）的VIGS，ROS反应显著下调。柱状图显示了ROS积累的总数和VIGS的沉默效率。重复三次独立实验，结果相似。使用学生t检验进行统计分析。误差棒代表SEM，^*表示差异显著（P<0.05），^**表示差异极显著（P<0.01）。

讨论

PAMP诱导的免疫反应（PTI）对卵菌致原菌的机制在很大程度上尚不清楚。本研究采用SWATH-MS的无标记定量蛋白质组学技术来筛选参与PTI抗晚疫病菌相关的蛋白质（图2）。晚疫病菌液体培养滤液（CF）用于提供PAMPs。在0、8、12、24和48 hpi时，本氏烟草中均鉴定到4401个蛋白质，并且有1429个蛋白在8 h、12 h、24 h、48 h四个时间点中至少一个时间点差异表达（图3，表S1）。利用时间序列表达谱聚类算法可将其划分为9个聚类（图4A）。聚类群7包含“胁迫响应”等一些与防御相关的GO术语（图4B）。然后，选取该GO术语中的19个DEPs作为候选蛋白，通过VIGS和ROS检测对其进行功能验证，结果显示有6个DEPs被证明参与了PTI反应（图5）。

前期，我们使用iTRAQ（Isobaric tags for relative and absolute quantitation，相对和绝对定量同位素标记）蛋白质组学技术探究了本氏烟草叶中参与PTI抗晚疫病菌的相关特异蛋白，总共鉴定到2964个蛋白，其中仅有32个受INF1诱导的DEPs。相比iTRAQ技术，SWATH-MS具有较高覆盖和更好的重复性，对样本量无限制，且可以定量到更多的低丰度蛋白。因此，本研究中我们可以检测到五个时间点的样本，而iTRAQ技术只能检测到8 hpi的一个时间点。此外，两种蛋白质组学方法中使用的诱导剂是不同的。INF1 elicitin被用于iTRAQ，而CF被用于SWATH-MS，它含有多种PAMPs，包括INF1、INF4、INF5等多种elicitin和一种多聚半乳糖。因此，CF可以诱导更多的DEPs和复杂的PTI反应。

我们验证了候选DEPs与细菌flg22诱导的ROS爆发反应有关，但这并不是来自晚疫病菌CF。然而，它们可能触发类似的PTI信号。实际上，我们还对候选DEPs的VIGS植物进行了CF浸润和INF1的农杆菌浸润。然而，CF或INF1介导的细胞坏死没有明显的减弱。我们猜测它们可能在PTI反应中起负面作用或具有冗余性。在VIGS植物上建立的flg22诱导的ROS爆发系统可以更好地量化它们对PTI反应的影响。实验结果同样表明，在已确定的六个DEPs中，与对照组相比，在用相应的TRV载体处理后，一个DEP起负面作用，其他五个DEPs部分影响ROS爆发。鉴定的6个DEPs包括MPT3、VAMP714、LysoPL2、APX1、HSP70-2和FKBP15-1。MPT3在植物细胞的ATP的产生中起着关键作用。在真核生物中，N-乙基马来酰亚胺敏感因子适配蛋白（SNAP）受体（也称为SNAREs）已进化为囊泡和靶标之间膜融合的媒介。拟南芥AtVAMP714对PIN蛋白和生长素反应的极化至关重要，而水稻OsVAMP714介导的运输途径被认为在稻瘟病抗性中发挥重要作用。LysoPL2参与了对镉诱导的氧化应激的耐受性，据报道其还具有咖啡酰莽草酸酯酶（CSE）的功能，该酶是拟南芥木质素生物合成途径中的一种酶，CSE将咖啡酰莽草酸转化为咖啡酸，其突变体具有降低木质素含量和收缩导管分子的作用。APX1在调控植物细胞中ROS的稳态水平方面发挥着重要作用。HSP70在细胞内含量最高，是HSP家族中最重要的一族，其在指导蛋白质正确折叠、维持蛋白质稳态和促进细胞在各种应激条件下存活等方面发挥着重要作用。有报道称，NbHSP70c-1（GenBank no. AB105430）对INF1诱发的细胞死亡至关重要。本研究中鉴定的HSP70-2与NbHSP70c-1具有约50%的氨基酸相似性，其作用可能与NbHSP70c-1相似。FKBP15-2被证明是ER胁迫介导的植物免疫所必需的。然而，它们参与PTI反应的机制仍需进一步探索。

总体而言，我们的研究为应用SWATH-MS方法研究植物免疫提供了一个范例。6个已鉴定的DEPs为进一步深入研究PTI的分子机制提供了新的线索。此外，所鉴定的1429个DEPs也为发现马铃薯晚疫病抗性反应中涉及的复杂蛋白网络提供了有价值的资源。

原文链接：  https://doi.org/10.3389/fpls.2022.1036637

----------微科盟更多推荐---------- 

      

如果需要原文pdf，请扫描文末二维码领取

请关注下方公众号

了解更多蛋白质组知识