科研│北京农林科学院:比较录组和蛋白质组谱揭示了低温调控大蒜变绿的机制（国人佳作）

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编译：微科盟，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读在低温（0-13℃）下储存一段时间后，将大蒜粉碎并放置在室温下会变绿，而在高温（30℃）下储存的大蒜则不会。为了阐明低温对大蒜变绿的调控机制，本研究通过RNA-seq和iTRAQ技术探索了4℃和30℃下大蒜的转录组和蛋白质组谱。主成分分析表明，不同贮藏温度下的大蒜在基因和蛋白质水平上都有显著差异。研究比较了4℃和30℃储存的大蒜，共鉴定了差异表达基因（DEGs）和蛋白质（DEPs）分别为14381个和861个，根据它们的联合分析，其中268个因素是共同的，包括186个（144个）上调的基因（蛋白质）和82个（124个）下调的基因（蛋白质）。根据Gene Ontology的分类，这268个因子主要归属于生物过程（代谢过程）和分子功能（催化活性，结合）类别。DEGs和DEPs的KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集显示，GSSG的产生、GSH的降解、氨基酸的生物合成（半胱氨酸和蛋氨酸）和能量代谢（TCA和HMP循环）被低温储藏所促进，以应对氧化应激，为大蒜的色素合成做准备。这些结果为大蒜加工过程中的绿化调节提供了有价值的信息。

论文ID

原名：Comparative transcriptome and proteome profiles reveal the regulation mechanism of low temperature on garlic greening

译名：比较录组和蛋白质组谱揭示了低温调控大蒜变绿的机制

期刊：Food Research International

IF：7.425

发表时间：2022年8月

通讯作者：王丹，赵晓燕

通讯作者单位：北京农林科学院

DOI号：10.1016/j.foodres.2022.111823

实验设计

结果

1.   在不同温度下储存的大蒜的颜色观察

研究者分别制备了4℃和30℃的大蒜，以探讨储存温度对大蒜变绿的调节机制。碾碎后在室温下放置24小时，之前在不同温度下储存的大蒜呈现不同的颜色（图1A）。与之前在30℃下以完整蒜瓣儿形式储存的白蒜肉相比，在4℃下储存的蒜瓣所得到的白蒜肉呈现出显著的绿色。这与Cho等人的研究相一致，即在低温下储存数周的大蒜碎末可以变成绿色。这种变化也从大蒜碎末的紫外-可见光谱中得到证实，如图1B所示。储存在30℃的大蒜碎末的紫外-可见光谱显然是平滑的，没有任何吸光度的峰值。而储存在4℃前的大蒜碎末分别在440nm和590nm处出现了两个吸光峰，分别代表了黄色和蓝色色素的最大吸光量。这与Lee等人的观点一致，即大蒜的绿色是由黄色和蓝色色素共同呈现的。毫无疑问，在4℃和30℃下储存一个月的大蒜将被用于后续分析。 

图1.在不同温度下（4℃或30℃）以全瓣形式储存的大蒜碎末在室温下的外观（A）和紫外可见光谱（B）

2. RNA测序数据，从头组装和蛋白质组表征

为了探讨低温贮藏对大蒜变绿的调控机制，研究者对不同贮藏温度下的两个大蒜样品的转录组和蛋白质组进行了分析。RNA-Seq结果如表1所示，共对6个样品，包括两个处理（每个处理3个生物学重复）及其进行了转录组测序，其中从309828070个raw reads中筛选出303017124个clean reads包括45Gb clean bases。6个大蒜样品的Q20和Q30的平均值分别为98.51%和95.37%，这反映了获得的碱基质量很高。

研究者通过对clean数据的重新组装，共获得213651个单基因和392046个转录本，平均长度为865.19 bp，N50为1238 bp（数据未显示）。以前，在葱属植物中已经进行了几种基因组组装，其中从大蒜的染色体级基因组组装中获得了大约16.24Gb碱基，有57561个被注释的蛋白质编码基因，通过对雪山大蒜的转录组分析，产生了326785个转录本（来自4300万301bp的配对端读数）。组装的转录本的长度分布如图2A所示，最多的转录本（110883）的最短长度在0到500bp之间，约占整个组装的52%，而只有624个转录本的长度在4001到4500bp之间。另一方面，蛋白质组分析显示，在6个大蒜样本中共鉴定了29987个肽，15163个蛋白质和5232个蛋白质基团（FDR＜0.01）（图2B）。上述RNA-seq和iTRAQ的基本信息表明了两种技术的可靠性和相应数据的实用性。

表1.RNA-Seq数据的质量评估。

注：Q20和Q30分别表示其中Phred值大于20或30的基数占总数的百分比。GC含量表示G和C的基数占总数的百分比。

图2.大蒜瓣样品组装后的转录本（A）和蛋白谱信息（B）的序列长度分布

3. 大蒜样品的比较PCA分析

主成分分析（PCA）是一种降维的多元统计分析方法，研究者对6个大蒜样品的差异进行了分析。基于基因和蛋白表达的PCA样本分布图分别见图3A和图3B，其中前两个主成分的累计方差贡献率分别为51.73 %和72.40 %。在这两个图中，样品分为两个不同的集群，4℃和30℃储存的大蒜和它们的生物复制品集合有显著的区别，这表明在不同温度下储存的大蒜在基因和蛋白质水平上都有显著的差异，从而导致收获后大蒜的生理代谢差异。 

图3.大蒜瓣样品的基因（A）和蛋白质表达（B）的PCA分析

4. DEGs和DEPs的联合分析

研究者鉴定了大蒜样品（4℃ vs 30℃）的DEGs和DEPs，以探索低温贮藏对大蒜变绿在基因和蛋白质水平上的调控机制。由于对研究对象的处理，在基因和蛋白水平上描述的生物事件可能会出现不完全一致的情况。为了获得可靠的数据，研究者采用了DEGs和DEPs的联合分析，同时注意到单组学数据和双组学分析数据之间的合理差异是不可避免的。

4.1   韦恩分析

 与30℃保存的大蒜相比，通过转录组和蛋白质组的差异表达分析，研究者在4℃的大蒜中分别发现了14381个DEGs和861个DEPs，其中268个因子在基因和蛋白质水平上都有显著调控（图4A）。在268个因子中，有186个基因被上调，82个基因被下调（图4B）。在蛋白质水平上，有144个上调的蛋白质和124个下调的蛋白质。此外，韦恩分析显示，208个因子的表达趋势在蛋白质和基因水平上都是一致的，有135个上调的因子和73个下调的因子。 

图4.大蒜样品中总的DEGs/DEPs（A）和共享因子（B）的联合韦恩分析

(DEGs：差异表达基因，DEPs：差异表达蛋白；"上"和"下"分别代表基因或蛋白的上/下调表达）。

4.2   GO功能注释

为了预测低温调控大蒜变绿的分子机制，研究者利用基因本体论（Gene Ontology，GO）研究DEGs或DEPs（DEGs/DEPs）在GO三个分支中的功能注释，其中前20个GO注释条目见图5。在生物过程类别中，DEGs/DEPs主要涉及代谢过程、细胞过程和单一生物过程。在分子功能方面，DEGs/DEPs主要参与了催化活性和结合。在细胞成分方面，DEGs/DEPs主要参与了细胞、细胞部分和膜。这些结果表明，细胞代谢过程，包括物质和能量的产生和交换，在低温调节大蒜变绿过程中起着重要作用。新陈代谢过程对植物的生长发育、组织结构的维持以及对外部环境的适应和防御反应具有重要意义。因此，可以从新陈代谢的角度探讨低温对大蒜变绿的调节机制。 

图5.含有大蒜中最大的 DEGs或DEPs的前20个GO注释条目

4.3   KEGG通路富集

根据双组学联合KEGG途径富集分析，研究者得到了前20条KEGG途径，其中DEGs和DEPs数量最多。如图6A所示，亚油酸代谢、谷胱甘肽代谢和叶酸的一个碳库是3个在基因和蛋白水平上都显著富集的共同途径。亚油酸代谢属于脂质代谢，是与植物风味品质的形成和发展以及膜完整性的维持密切相关的重要代谢途径。与本研究的结果一致，以前的研究表明，谷胱甘肽代谢是植物防御系统的重要组成部分，可能参与色素前体的合成，同时为这一系列的生化反应提供还原力（NADPH）。一方面，DEGs在MAPK信号通路-植物、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸降解、光合生物的碳固定中显著富集，除了前面提到的3个通路，主要与信号转导、氨基酸代谢和能量代谢有关。另一方面，DEP显著富集的途径可以分为三类：剪接体和内质中的蛋白质加工与基因信息处理有关；内吞作用属于细胞过程；角蛋白/黄嘌呤/蜡的生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、抗坏血酸和醛酸盐代谢涉及新陈代谢。这些结果表明，谷胱甘肽代谢、氨基酸代谢和能量代谢在低温调节大蒜变绿中起着重要作用。Zang, Wang & Zhao提出，γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）参与大蒜绿色素的形成，它也是参与植物中谷胱甘肽代谢和氨基酸代谢的关键酶。此外，能量代谢与收获后水果和蔬菜的生理代谢和加工性能密切相关，如储存过程中的成熟度和变质，加工过程中的颜色和风味质量等。

图6B显示了显著富集的KEGG途径中的DEGs和DEPs的表达和相应的数量。在谷胱甘肽代谢中，28个基因和14个蛋白质被下调。在氨基酸代谢中，包括半胱氨酸/蛋氨酸代谢和缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸降解，50个基因被上调，22个基因被下调。在光合生物的碳固定（能量代谢）和MAPK信号通路-植物中，分别有30和21个基因上调，6和37个基因下调。 

图6.KEGG途径富集分析

A：根据富集程度，大蒜中DEGs或DEPs的前20条通路。B：在关键KEGG途径中富集的DEGs和DEPs的表达。 

5. DEGs和DEPs与低温调控大蒜变绿有关

为了研究低温对大蒜变绿的具体分子调控机制，根据前面的分析，将参与谷胱甘肽代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、亚油酸代谢和叶酸一碳库的主要调控因子列在表2中（只列出在基因和蛋白水平上表达一致的因子）。据报道，谷胱甘肽还原酶（GR）可以催化谷胱甘肽的氧化形式GSSG向还原型GSH的转化，而谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）发挥相反的作用。与在高温（30℃）下贮藏的大蒜相比，在低温下贮藏的大蒜中GSR的表达被下调，而GPX的表达被上调，无论是在基因还是蛋白水平（表2）。这些变化可能诱导大蒜组织中的GSSG增加，以抑制自由基的产生，避免质膜过氧化，最终维持细胞的平衡，以应对低温胁迫。谷胱甘肽转移酶（GST）是一个庞大而多样的酶群，可以催化亲电性外源物质与GSH的共轭结合。GST的表达被5个基因上调（表2），可能导致低温储存大蒜中GSH的减少，这与GSR的表达下调和GPX的表达上调是一致的。同样，pepA和pepN的表达在基因和蛋白水平上都被上调，这导致了从三肽谷胱甘肽到单一氨基酸的降解，可能与大蒜中蓝绿色素的前体GSAC和GSPC的合成有关。抗坏血酸-谷胱甘肽循环是植物在应对环境胁迫时维持细胞平衡的重要循环，其中L-抗坏血酸过氧化物酶（APX）是循环中必不可少的限速酶，可以催化抗坏血酸的氧化导致形成脱氢抗坏血酸（DHA）。6个基因诱导的APX表达上调可能表明大蒜对低温的应激反应（表2），与谷胱甘肽代谢的分析结果一致。

表2.在30℃和4℃保存的大蒜中，选定的代谢产物DEP和DEG的表达情况

除物质代谢外，低温储存的大蒜中蓝绿色素的产生无疑也依赖于能量供应。葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶（G6PDH）和异柠檬酸脱氢酶（ICDH）可以分别催化6-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖酸和异柠檬酸转化为α-酮戊二酸，同时伴随着NADP⁺到NADPH的转化，它们分别属于三羧酸循环（TCA）和六糖单磷酸酯分流（HMS）。从表2中不难看出，与30℃的大蒜相比，4℃的大蒜中IDH1和G6PD的表达量上升，这可能为低温贮藏下大蒜的谷胱甘肽代谢和色素的合成提供了还原力NADPH和ATP。以往的一些研究也促进了能量代谢与萝卜根、龙眼果和莲藕在贮藏期间的变色密切相关。

氨基酸对于精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等蓝绿色素的生物合成非常重要，因此氨基酸代谢在低温调控大蒜变绿中发挥了重要作用。如表2所示，所有参与半胱氨酸和蛋氨酸代谢的关键调节因子（speE、cysK、metC、metE、TAT、GOT1、MDH1、MDH2、mmuM、metK和ahcY）在基因和蛋白水平上都显著上调，表明大蒜中半胱氨酸和蛋氨酸的生物合成和代谢在低温储藏下得到促进。此外，这些因素也参与了其他氨基酸的代谢，如精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸以及谷胱甘肽，这些都是低温贮藏大蒜生产色素的准备。

6. 基因和代谢物验证

如图7所示，研究者对与低温调节大蒜变绿有关的关键调节因子的表达水平和关键代谢物的含量进行了验证。对谷胱甘肽代谢相关基因的实时定量PCR分析表明，与30℃的大蒜相比，4℃储存的大蒜中IDH1、pepA、G6PD、GST和GGT的表达水平分别上调了2.19、1.93、13.36、4.44和1.91倍，而GSR和PGD则分别下调了0.65和0.62倍（图7A），这与RNA-seq数据一致，说明转录组学的可靠性。如图7B所示，4℃贮藏的大蒜组织中ATP含量显著高于30℃的大蒜，说明低温贮藏通过TCA循环和HMS途径为大蒜发绿提供了必要的、足够的能量。总的来说，低温贮藏的大蒜的氨基酸含量高于高温贮藏的大蒜，尤其是丙氨酸、精氨酸和天冬氨酸的含量分别高出25%、18.99%、11.43%（图7C），说明低温贮藏可以促进大蒜中氨基酸的积累，为大蒜的色素合成和变绿提供充足的反应物。这与Zhao等的研究结果一致，即丙氨酸或精氨酸与1-PeCSO、2-PeCSO和Alliinase混合后，在4小时的模型反应中可以产生蓝色色素，其中也确定了色素前体和相应的色素化合物。Wang,Nanding,Han,Chen & Zhao和Lee & Kyung的研究也促进了大蒜变绿是大蒜硫代磺酸盐与不同类型的水溶性氨基甲酰反应的结果。研究者测定4℃和30℃储存的大蒜中的色素前体，发现4℃的大蒜中GSPC较少，而1-PeCSO较多，这表明在低温储存下，由GSPC转化的1-PeCSO较多，为合成吡咯环类绿色色素和大蒜变绿做好了准备。

图7.谷胱甘肽代谢、氨基酸代谢、能量代谢和色素前体在不同温度下储存大蒜中的验证

A：参与谷胱甘肽代谢的DEGs的qRTPCR分析；B：ATP含量；C：氨基酸含量；D：色素前体含量。(GSPC:γ-L-谷氨酰-S-(反式-1-丙烯基)-L-胱氨酸酶,1-PeCSO:S-1-丙烯基-L-半胱氨酸亚砜）。

图8.低温对大蒜变绿的调控机制模型

黑色箭头指向被作用或产生的化合物，周围标注了主要的催化酶和调节基因。缩略语。三羧酸循环，TCA；单磷酸己糖分流，HMS；异柠檬酸脱氢酶（细胞液），ICDHc；葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶，G6PDH；6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，PGD；谷胱甘肽还原酶，GR；谷胱甘肽过氧化物酶，GPX；谷胱甘肽S-转移酶，GST；抗坏血酸，AsA。L-抗坏血酸过氧化物酶，APX；单脱氢抗坏血酸，MDHA；脱氢抗坏血酸，DHA；脱氢抗坏血酸还原酶，DHAR；γ-谷氨酰环转移酶，GGC。γ-谷氨酰转肽酶，γ-GT；γ-谷氨酰半胱氨酸，γ-EC；半胱氨酸，cys；甘氨酸，Gly；谷氨酸，Glu；半胱氨酰甘氨酸，Cys-Gly。

结论

本研究结果表明在4℃和30℃下储存的大蒜在基因和蛋白质水平上都有显著差异。研究者通过对大蒜样品中的DEGs和DEPs的联合分析，共鉴定出268个因子，其中186个基因和144个蛋白显著上调，而82个基因和124个蛋白在4℃和30℃储存的大蒜之间的比较中下调。转录组和蛋白质组图谱显示，谷胱甘肽代谢、能量代谢（TCA和HMS循环）和氨基酸代谢（半胱氨酸和蛋氨酸代谢）是低温调节大蒜变绿的主要原因。详细地说，低温贮藏下大蒜绿色色素前体的生物合成是通过对参与GSSG产生、GSH降解和氨基酸生物合成的关键酶在基因和蛋白质水平上的不同调节来准备的，同时通过TCA和HMS循环充分供应NADPH和ATP（图8）。这些发现也在谷胱甘肽代谢的关键调控因子的qRT-PCR分析和ATP、主要氨基酸和色素前体（1-PeCSO和GSPC）的含量测定中得到验证。本研究为加工过程中大蒜变绿的调控提供了宝贵的策略，包括加工条件的控制，甚至是新型生物信息学的应用。
原文链接：  https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S096399692200881X?via%3Dihub=

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