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综述（IF: 59.581） |Nat. Rev. Genet：癌症进化的空间生物学
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编译：微科盟Wicro，编辑：微科盟Emma、江舜尧。
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导读癌症的自然史可以通过进化的视角来理解，因为癌症发展的驱动力是突变和选择更合适的克隆。癌症的生长和恶化是涉及正常器官组织破坏、侵袭和转移的空间过程。因此，空间模式通过测量从正常到恶性疾病的进展，是肿瘤组织学分级和分期的一个组成部分。此外，肿瘤细胞是肿瘤细胞及其周围肿瘤微环境生态系统的一部分。空间基因组学、转录组学和蛋白质组学等一系列新的技术为研究癌症进化相关的重要分子和空间细节的提供了新途径。通过这些方法，我们能够精确表征肿瘤微环境、其中的细胞相互作用和微解剖结构。结合空间基因组学来研究肿瘤和微环境共同进化，将有助于解释可观察到的异质性模式，并为治疗干预提供新途径。
论文ID
原名：Spatial biology of cancer evolution 译名：癌症进化的空间生物学期刊：Nature Reviews GeneticsIF：59.581发表时间：2022.12通讯作者：Moritz Gerstung通讯作者单位：德国海德堡大学德国癌症研究中心
主要内容
进化的驱动力是突变和选择。生命过程中，体细胞都在不可避免的积累突变。在大多数正常组织中，突变是以每个细胞每年约15-50个的稳定速率来进行累积的，而目前只有癌症相关胚系（germline）突变率较低。由于肿瘤细胞在生命过程中经历了多种突变过程，并且在某些情况下获得性超突变，肿瘤细胞通常会表现出较高的突变负担。突变的不断积累不可避免地导致肿瘤和正常组织中单细胞水平的多样化。进化的第二种力量是选择，它描述了更适应的血统如何超越其亲属。选择在源自基因组学和表观基因组学的广泛可遗传表型的水平上进行。在所处环境中具有选择优势的克隆将扩展，而具有劣势的克隆将趋于消失（图 1a）。因此，在老化的正常组织和癌症的基因组中富集了有利的变体。迄今为止，已报道了500多个所谓的癌症驱动基因，这些基因被认为会导致不同的癌症标志性特征和促成特征，这些特征涉及细胞内在机制以及与肿瘤微环境(TME)的相互作用。在单细胞水平上, 虽然突变不断产生亚克隆多样性，但有充分证据表明，肿瘤是亚克隆的嵌合体，每个亚克隆都包含数十万个来自共同祖先的细胞（图 1a）;多个课题已经通过单细胞研究进一步证实了这些模式特征。然而，这些扩张的机制仍然存在争议。已经表明，癌症亚克隆表现出阳性选择和驱动基因突变的迹象，这些迹象也可以在克隆中发现。另外，在肿瘤发展的早期阶段分支的亚克隆，随着相同的肿瘤继续扩展，在没有选择优势的情况下达到相当的大小，这种现象称为中性进化。正如基于肿瘤宏观解剖和激光捕获显微解剖的多项研究所证明的那样，亚克隆镶嵌现象在空间上是多样化的（图 1b）。使用空间分辨基因组和转录组学分析显示，这些克隆变异模式伴随着多种癌症类型的差异基因表达，包括肾癌、结直肠癌、肺癌和乳腺癌，表明存在亚克隆特异性基因表达和某些亚克隆之间的关联和特征TME。目前由于缺乏能够以空间分辨率对整个肿瘤切片进行分子表征的方法，所以对产生这些现象的确切机制尚不完全清楚。对此，也有多种非排他性（或具有包容性）的解释被提出。尽管也有人认为细胞扩散是形成肿瘤结构的关键因素，但是快速扩张可能导致密切相关的克隆分裂。然而，组织微解剖学（例如乳房的导管系统）也可能为克隆分离提供模板（在“器官组织控制进化”一节中进一步讨论）。最后，可以想象，局部不同的微环境或生态位有利于选择特定的克隆。各种新的空间分辨基因组学、转录组学和蛋白质组学技术为这些未解决的问题提供了新的见解和答案（图 1b）。专栏1 中总结了支持空间癌症生物学这一新兴领域的技术，并在其他地方进行了广泛审查。各种技术在读数的多样性、空间分辨率以及灵敏度和可用视野方面各不相同。结合基因组学、转录组学和蛋白质组学层可以对肿瘤生态系统进行丰富的表征。
在这篇综述中，我们主要聚焦癌症进化的空间方面，总结空间转录组学和蛋白质组学在如何揭示肿瘤生态系统的复杂景观，讨论与TME的相互作用如何成为癌症进化的组成部分，并提出潜在的临床应用和未来方向。我们特别关注组织微解剖学在控制进化速度以及细胞与癌细胞进化的TME的相互作用中的作用。
专栏 1 使能技术（Enabling technologies）已经开发了一系列用于绘制DNA、RNA和蛋白质的空间分辨方法。更高的空间分辨率通常意味着更小的分子数量（专栏图1，a 部分）。其他重要参数是视野（范围从平方毫米到平方厘米）和方法灵敏度。宏观解剖和显微解剖宏观解剖奠定了基础，随后进行了多组学分析，但新技术提供了微观和单细胞分辨率（专栏1图b）。在多区域测序中，从多个地理上分离的组织区域收集多个活检样本，然后再对DNA或 RNA进行批量测序。激光捕获显微切割 (LCM) 允许使用激光烧蚀对更小的感兴趣区域进行分析。LCM非常通用，因为它可以与高通量测序相结合，包括全基因组测序和单细胞RNA或DNA测序。空间分子条形码这组方法利用具有独特条形码序列的探针来捕获分子，然后将它们映射到特定的空间位置（专栏1图c）。到目前为止，这些技术主要集中在空间转录组学、10x Visium和 Slide-seq的转录组学分析上，这是许多其他技术中最流行的方案。空间分辨的DNA序列捕获已经实现了空间分辨的全基因组拷贝数调用以及用于空间表观基因组分析的几种新方法。虽然这些方法支持无偏见的发现并产生具有高分子含量的数据，但是分辨率受到每个点直径的限制，目前不允许在单细胞水平或点突变检测上进行分析，分辨率正在进一步改进。基于图像的技术这组方法涉及荧光标记探针(FISH)与目标核酸的原位杂交，以通过单细胞或亚细胞分辨率识别它们的位置（专栏1图d）。存在多种多重扩展，包括多重抗错FISH (MERFISH)、顺序 FISH (seqFISH)、RNAscope和用于空间转录组学分析的原位测序(ISS)。后两个研究方案已进一步调整以允许使用Base Scope和 BaSISS 方案进行突变检测。免疫组织化学 (IHC)或免疫荧光使用抗体来定位蛋白质或其他分子。使用DNA条形码、多重免疫荧光(CyCIF)和其他方法可以实现具有数十个目标的高度多重空间蛋白质组学。多组学方法，例如GeoMx或CosMx，允许研究人员同时评估一个细胞内的多层生物信息。基于图像的技术提供高分辨率的组织分析，但需要预先定义的目标面板。质谱另一类方法结合了金属偶联抗体和质谱法（专栏图1e）。空间分辨率由空间激光烧蚀（成像质量细胞计数 (IMC)）或离子束（多路离子束成像 (MIBI)）提供。这些方法检测单细胞中的蛋白质和较小的分子，例如脂质、代谢物和药物。深度视觉蛋白质组学(DVP)将人工智能驱动的LCM与质谱相结合，将蛋白质丰度映射到组织载玻片上。
2. 器官组织控制进化
恶性克隆在组织中出现和传播的速度由其所在的器官或组织控制。组织层次包括微观解剖组织结构以及分化层次结构，很少有干细胞连续喂养更大的分化细胞池。这些保护原则的崩溃是癌症发展的一个关键特征。然而，常驻组织结构，例如乳房的导管系统或食道的上皮层，也会影响侵入前阶段的进展速度。转化过程最终以转移性疾病结束。
2.1 正常器官组织抑制进化长期以来，人们一直假设体细胞组织的结构可以抑制体细胞进化的速度。这些想法基于进化速度取决于种群结构的基本理论考虑。一般来说，进化的速度取决于新突变的产生速度（细胞数量和每个细胞的突变率的乘积）、新突变体席卷整个种群的概率以及这样做所需的时间。除了抑制突变率外，分化等级还可以减少出现的机会并减缓突变谱系的传播。造血系统构成了一个基本的例子：它的1013个细胞来自大约100,000个造血干细胞，这些细胞自身分裂缓慢并产生一系列分裂更快的分化细胞。这种等级制度降低了进化速度，因为只有数量相对较少的干细胞和潜在的第一代祖细胞中的突变，或导致分化受阻的突变，才会保留在种群中。结肠通过将其划分为微解剖隐窝来扩展这些组织原则；在每个隐窝中，都有一个类似的分化层次结构，其中极少量的干细胞补充结肠上皮细胞。由于分化细胞注定会在约5天内死亡，因此只有干细胞中出现的突变会持续存在。此外，显微解剖学在很大程度上限制了干细胞突变对单个隐窝的固定（图 2a）。对正常组织的系统研究证实，在具有更复杂结构的组织中，与结构较差的组织相比，克隆通常保持较小的尺寸并独立发育，后者的克隆扩增往往较大。在最近对517个正常结肠隐窝的调查中，只有1%具有癌症驱动基因突变，而那些发生突变的则仅限于单个隐窝。对腺体组织（如子宫内膜）也进行了类似的观察：尽管大多数腺体都有驱动突变，但它们仅限于单个突变或几个相邻的突变。相反，众所周知，造血系统含有突变谱系，其频率可高达100%。其他上皮组织，包括皮肤、食道或膀胱，具有中等程度的组织结构，并且是微观克隆的拼凑物（图 2a）。在此类组织中，固定概率很高，但固定时间比造血系统长，因为动力学仅限于二维，这减少了更适合的变体可能取代不太适合的竞争者的界面。值得注意的是，并非所有导致选择性优势的突变都与恶性转化有关。例如，在皮肤和食道中NOTCH1突变克隆在维持正常组织功能的同时扩大并抑制恶性进化。
2.2 癌症中进化限制组织结构的分解去分化和正常组织结构的丧失与癌症侵袭性相关的基本观察是一个世纪前做出的，并且仍然构成指导癌症治疗的现代组织病理学分级系统的一部分。在这些系统中，较高的等级对应于更具侵袭性的肿瘤，通常由分化程度较低的细胞组成。这种进化限制组织结构的破坏是癌症的标志。它在源自上皮组织的癌中尤为明显（图 2b）。在进展的最早阶段，所谓的原位癌仍然局限于常驻组织结构，例如乳腺导管。与正常组织的考虑类似，常驻组织结构可能会延迟克隆扫描。这种基于组织的限制在乳腺癌病例中被观察到，其中空间基因组分析显示两个不同的亚克隆占据导管系统内微解剖壁龛的棋盘图案。在侵袭过程中，组织结构丢失，可能是通过每种组织类型的不同机制，但癌的一个常见特性是上皮-间质转化(EMT)。 EMT使上皮细胞失去其极性并脱离平面上皮器官组织的限制。在结直肠腺癌中，EMT可以通过 APC 中的功能丧失突变或CTNNB1抑制其降解的体细胞突变，通过WNT信号通路诱导。这两种改变被认为是腺瘤发展的关键步骤，腺瘤是浸润性腺癌的肿瘤前体。入侵的进一步步骤是细胞外基质(ECM)的分解和重塑，微环境也促进了这一过程（参见“绘制癌症生态系统”部分）。这种崩溃的结果可能是恶性进化的加速，因为在混合程度更高的非结构化种群中，固定概率和固定率更高。一些理论研究表明，空间约束可以控制肿瘤进化的模式。另一个结果是应用了不同的选择压力，这可能是癌症进展特征序列的一个原因，例如结直肠癌的经典APC-KRAS-TP53 模型和胰腺导管腺癌进展中 TP53失活的四个阶段从恶变前状态到恶变状态。有鉴于此，一项泛癌分析表明，晚期和亚克隆驱动基因突变的组合往往比早期改变的组合更加多样化。
2.3 转移播散癌细胞离开原发肿瘤部位并在远处器官播种并产生转移性沉积物的能力，通常是具有里程碑意义的阶段，因为这些阶段强烈预示着不良的临床结果。这种固有的空间过程涉及组织侵入、单个或小癌细胞聚集体的内渗、通过血液系统的循环、在靶器官的毛细血管中停滞、外渗和增殖（图 2b）。因此，这些步骤涉及一系列微观解剖学瓶颈以及不同阶段和目标器官可能存在的差异选择压力。几项多区域基因组测序研究调查了同一患者原发肿瘤和转移瘤的系统发育关系。这些数据表明，大多数转移瘤通常在其最近的共同祖先之前或之后不久从原发性肿瘤克隆中分离出来，通常是在诊断前1-5年。 转移的起源主要还是克隆，尽管在晚期疾病中，在多处转移中发现了混合亚克隆，这表明从一个转移扩散到另一个转移。转移性癌症的泛癌分析表明，与原发性肿瘤相比，转移性癌症表现出较少的转移内亚克隆，这部分原因是由于采样较少的细胞（通常是核心针活检）。从驱动基因突变的角度来看，有人认为，未经治疗的转移与匹配的原发性转移具有大致相同的驱动基因突变。转移性癌症的特征包括原发肿瘤和转移瘤共有的高度基因组不稳定性、TP53突变和全基因组重复。然而，辅助疗法可以选择特定的突变，例如，用内分泌剥夺疗法治疗的前列腺癌和乳腺癌分别富含AR和ESR1中的耐药突变。尽管组织结构对体细胞进化具有深远影响，但重要的是要认识到细胞与正常细胞的相互作用也可能影响癌症克隆的命运。 TME的组成及其在癌症进化中的作用将在接下来的两节中讨论。
3. 绘制癌症生态系统
肿瘤块的细胞组成变化很大，在某些情况下，肿瘤谱系仅占细胞的10%。其余细胞来自TME，除了血管、脂肪细胞和周细胞外，TME通常由免疫细胞和基质细胞主导。这些细胞和其他物理结构（例如ECM和化学梯度）一起形成了一个称为癌症生态系统的环境。在过去十年中，单细胞RNA 测序 (scRNA-seq)分析对癌症生态系统的细胞组成进行了分类。最近，空间转录组学和蛋白质组学技术开始揭示这些不同的细胞类型如何组织成通信接口和壁龛（专栏 1 和 2）。
专栏2 空间组学分析（Spatial omic analysis）典型的肿瘤横截面覆盖几厘米的组织，其中包含多达 1,000,000 个细胞。空间组学方法以约 0.2微米的分辨率表征这些细胞的分子特征，具体取决于方法。数据的丰富性和细节性带来了一系列的数据分析挑战（见专栏2图）。原始信号分析对于基于分子条形码的技术（专栏1），原始数据处理的主要步骤包括对齐和计数每个感兴趣的基因组区域的读数或分子条形码，以及定义空间扇区的测序条形码。相比之下，基于图像的方法利用通常跨多个荧光通道和周期测量的荧光信号。这些信号必须被检测、量化并解码为相应的目标分子，这些目标分子可以通过跨周期的特定颜色组合来定义。对于整张幻灯片成像，需要将视野拼接成一张组织图像。背景荧光、模糊和信号拥挤会对解码信号的能力产生负面影响。具有超细胞分辨率的技术需要细胞分解算法，其中通常从单细胞数据中获得的已知细胞类型用作参考。具有亚细胞分辨率的信号通过聚类或基于源自核DAPI信号、膜标记或苏木精和伊红(H&E)染色的细胞分割进行空间聚合。数据整合单细胞解析数据可以映射以对较大的点进行反卷积或注释已知的细胞类型。单细胞全转录组或多组学可以进一步映射到空间，利用一组较小的公共参考基因，这些参考基因在空间上被询问。另一种选择是整合来自连续组织切片的多种空间分辨模式。扭曲切片的对齐和组织块的3D重建可以使用图像配准算法来完成。显微镜下匹配的组织区域的多模式表征，包括空间转录组学、蛋白质组学和组织病理学，也是可能的。空间统计空间差异表达模型能够描述新的细胞状态，显示出难以从单细胞数据中恢复的不同空间模式。一组细胞可能会以一种循环的方式出现，形成不同的邻域，这种模式可以被各种主题和基于图形的模型所采用。机制模型试图解释由细胞间相互作用和细胞界面信号传导介导的表达可塑性。空间谱系追踪空间RNA或DNA测序技术提供广泛但低的基因组覆盖，这将谱系追踪限制在拷贝数改变和几个点突变。当前的协议还具有相对较低的空间分辨率（专栏1）。显微镜方法针对特定的点突变，并且需要克隆结构的先验知识。然而，它们实现了更高的空间分辨率，可以在广阔的视野中绘制更细粒度的克隆结构。分支进化的增量性质也提供了将每个分支上的遗传变化与表型变化联系起来的机会。
3.1 TME的细胞组成TME已被广泛研究，因此，我们在此仅提供主要细胞类型的高级摘要。炎症是癌症的标志，反映了抗肿瘤发生和促肿瘤发生免疫反应的相互作用（图 3a）。抗肿瘤反应主要由识别肿瘤细胞表面抗原的细胞毒性CD8+ T淋巴细胞产生。这种反应的成功取决于专业抗原呈递细胞（树突状细胞）的启动和先前教育，并由 CD4+ T辅助细胞促进。 B细胞具有多种功能，包括抗原呈递、抗体产生和细胞因子介导的细胞溶解作用。在许多癌症中，B细胞与T细胞和树突状细胞形成致密聚集体，形成三级淋巴结构，这些结构通常与有利的癌症结果和对免疫检查点阻断的反应相关。自然杀伤细胞可能在抗癌免疫中起着特别重要的作用，因为它们能够识别应激细胞，而不管新抗原呈递如何。相比之下，CD4+调节性T (Treg)细胞可以通过细胞因子释放（例如IL-10）或通过调节抗原呈递功能来抑制免疫反应。在某些情况下，一些免疫细胞，如巨噬细胞、髓源性抑制细胞和粒细胞，可以通过与肿瘤、其他免疫细胞和基质的双向相互作用积极促进肿瘤进展。间质还在塑造对癌症的功能性免疫反应中发挥积极作用。各种研究表明，癌症相关的成纤维细胞和肌成纤维细胞通常会改变形状，变得更加增殖，经历不同的转录和代谢变化，参与血管生成，并与白细胞和肿瘤细胞相互作用，同时导致ECM的化学成分和机械特性发生变化。
3.2 细胞相互作用和邻域尽管scRNA-seq研究已经生成了详细的TME细胞类型和状态的综合目录，但这些数据只能提供对细胞相互作用方式的间接洞察。空间转录组学和蛋白质组学技术开始表明，构成癌症生态系统的细胞自组织成微解剖学邻域，这可以深入了解不同细胞相互作用的频率和性质（图 3b-d 和专栏2）。迄今为止，大多数空间组学癌症研究都使用由10x Visium 商业化的空间转录组学（专栏1）。这些研究揭示了乳腺癌、前列腺、胰腺、结直肠癌、皮肤、大脑、肝脏、膀胱和其他癌症类型中的空间结构TME。使用全转录组读数的能力也有助于确定稀有细胞类型的存在和广泛共定位（图 3b）。然而，当前的超细胞分辨率（55微米，约3-10个细胞）需要对每个点的测量信号进行信息反卷积。高度复用的抗体检测方法已被用于生成乳腺癌、结肠癌和黑色素瘤等主要细胞类型空间分布的单细胞分辨率读数。这些方法允许检测具有不同肿瘤、免疫、基质和血管细胞组成的微观邻域。在通过将成像质谱流式细胞术（专栏 1）应用于组织微阵列来分析数百种乳腺癌的两项研究中，确定了几个复发性邻域（图 3c）。确定的社区的生物学可行性是由它们与明确定义的临床亚型和生存结果的关系提供的。例如，与失败的抗肿瘤发生反应一致，“抑制的扩张结构”包含许多功能失调的T细胞和Treg细胞，并且在临床结果不佳的乳腺癌中富集。相比之下，“血管基质”特征在激素受体阳性乳腺癌的一个非常有利的结果亚组中得到丰富（图 3c）。还检查了由单个细胞类型形成的空间模式。在乳腺癌中，虽然T细胞呈弥散分布，但B细胞倾向于形成聚集体，存在于多种邻域类型中，并且与不同的临床亚型和临床结果相关，这表明B细胞功能可能依赖于精确的TME背景（图 3c)。然而，一些肿瘤表型，例如细胞增殖，可以通过进一步的远程相互作用来塑造。细胞的接近度不一定等同于相互作用。为了解决这个限制，CyCIF（专栏1）和高分辨率三维光学反卷积的组合被用来研究可能与细胞相互作用相关的物理特征。在黑色素瘤组织中，在肿瘤-基质界面的大约20%的免疫细胞中发现了可能的相互作用（图 3d）。这些相互作用通常很复杂，涉及三个或更多细胞（例如，一个黑色素瘤细胞接触两个CD8+细胞毒性T淋巴细胞和一个CD4+Treg细胞）以及相关的细胞表面分子极化和受体-配体相互作用。在某些情况下，巨噬细胞的细胞突起延伸超过10μm以与其他细胞接触。标准的精细部分会错过许多这些相互作用，而基本的接近度测量往往会高估相互作用的性质。正如专栏 2 中所讨论的，尽管这些分析在技术上仍然具有挑战性并且通量较低，但它们证明了空间组学为组织空间中功能性细胞相互作用的映射提供的独特潜力。
3.3 肿瘤组织学和宏观结构肿瘤细胞的组织学外观及其微解剖结构也反映了潜在的基因组改变，正如最近两项使用基于人工智能的数字组织病理学进行的泛癌分析所揭示的那样。在某些情况下，已发现组织学模式甚至可以指示不同的亚克隆改变。众所周知，肿瘤表现出表明其自然史的特征性组织学结构（图 3e）。许多癌症显示邻近的原位癌区域，这被认为是前驱病变。这种现象在黑色素瘤和许多腺癌中得到证实：在乳腺癌中，多达三分之二的病例具有组织学上不同的原位导管癌区域，约15%的结直肠腺癌表现出相邻的腺瘤，约45%的食管腺癌显示可检测其前驱病变巴雷特食管（Barrett食管)的区域。有趣的是，前驱病变和浸润性癌症之间的系统发育和组织学关系并不总是与指示分支或多克隆入侵的模式一致。因此，使用组织学信息解剖的空间基因组学和转录组学分析允许更详细地探索疾病进展的机制和表型，揭示亚克隆和组织学特异性变化。在毫米的尺度上，癌症通常被描述为肿瘤核心，该肿瘤核心与周围的间质之间存在浸润性边缘（图 3e）。已经报道了这些景观中的转录多样性，缺氧和EMT样特征分别位于核心和侵入边缘。核心-基质的区别是免疫浸润常见分类的基础，免疫浸润与癌症亚型、临床结果和治疗反应相关。免疫浸润连续体的一端是发炎的肿瘤，其中大量免疫细胞浸润到肿瘤核心，另一端是没有浸润的免疫荒漠，在它们之间是免疫排除的肿瘤，其中免疫细胞主要局限于相邻的基质。然而，最近对胰腺癌和乳腺癌的空间研究表明，这些免疫特征可以高度定位并共存于同一肿瘤的不同部位。因此，一个挑战将是破译免疫反应的局部变异如何影响肿瘤的进化结果。
4. 癌症生态系统的演变
上一节详述的癌症生态系统改变了癌症进化的动态，因为肿瘤细胞面临着最大限度地促进生长和最小化生长抑制相互作用的选择压力。最重要的是细胞-细胞和其他与免疫系统的局部相互作用，还有与成纤维细胞、脉管系统甚至神经元的相互作用，这可能导致特定基因组改变的选择（图 4a）。 TME本身在空间上具有异质性这一事实表明，肿瘤细胞会经历选择压力的局部变化。
4.1 免疫逃避的进化免疫系统的各个部分都会抑制肿瘤的生长。观察到的特定基因改变与TME免疫系统细胞之间的关联范围说明了癌症进化中存在选择压力。据报道，源自癌症基因组编码突变的新抗原可在肺癌中引发T细胞反应性。在具有更高细胞溶解活性的肿瘤中，新抗原呈递能力的丧失更频繁，这表明更大的选择压力。选择免疫逃避的其他迹象包括CASP8中的突变，这是一种潜在的方法来抵抗 FASL诱导的细胞凋亡。此外，CD274（也称为 PDL1）等免疫抑制剂的增加在霍奇金淋巴瘤中很普遍，并且在约0.7%的实体瘤中检测到。在癌症进化的后期阶段，免疫逃避的迹象会增加。在正常组织的二倍体基因组和原发性癌症的克隆改变中没有报告负选择的证据，表明在正常进化过程中没有编码突变的耗尽。然而，在亚克隆水平的克隆扩增后，免疫逃避选择的迹象变得更加强烈。例如，在肺癌和多种其他癌症类型中描述了通过缺失人类白细胞抗原 (HLA) I 类等位基因（主要是亚克隆和转移）进行的免疫逃避（图 4a）。这种进化模式是合理的，因为它可能需要一定的肿瘤大小才能让免疫系统识别其新抗原；然而，在这个阶段，能够逃避这些新的选择压力的突变出现在肿瘤的单个细胞中，并播种肿瘤亚克隆的生长。虽然它有可能取代所有其他肿瘤细胞，但发生这种情况的时间取决于免疫控制的强度及其逃逸率。此外，免疫系统的选择性压力决定了预后，并且在复发中发现了免疫逃避。据报道，强免疫原性新抗原对胰腺癌的预后有利，但在复发时优先丢失。在黑色素瘤中，抑制细胞溶解的JAK1或JAK2突变，以及减少抗原呈递的B2M突变，通常在对免疫检查点抑制剂产生耐药性的样本中发现。
4.2 癌症-TME相互作用图由于原发性癌症之间存在较大的基因组异质性，因此在基因组改变与微环境之间建立关联可能具有挑战性。从概念上讲，空间基因组学提供了在高空间分辨率下以及在同一肿瘤内分析此类相互作用的新方法。对于肿瘤内多样性，观察发生在同基因背景下，与较大的肿瘤间多样性相比，亚克隆之间的基因组差异集很小（图 4b）。已经在乳腺癌中建立了概念验证，在癌症亚克隆水平上发现了不同程度的免疫浸润。有趣的是，这些观察结果也可能与侵袭阶段有关，一些TME 区域由亚克隆谱系定义，而其他区域主要由从原位癌到浸润性癌的组织学进展定义。小鼠体内空间CRISPR筛选Perturb-map提供了直接实验证据，表明特定基因敲除会导致免疫微环境发生特征性变化。例如，T细胞浸润因肿瘤中的 Socs1敲除而增加，但因Tgfbr2敲除而减少（图 4b）。免疫细胞以外的其他细胞类型与癌症进化有关。成纤维细胞是一组用途极为广泛的细胞，在肿瘤生长过程中发挥着多种作用。例如，癌症相关的成纤维细胞可以通过在TP53中具有功能获得性突变的癌细胞进行教育，以创建促肿瘤发生的微环境。此外，成纤维细胞可以放大KRASG12D突变型胰腺癌中的肿瘤固有致癌信号。空间基因组学增加了这些观察结果。在乳腺癌中，成像质谱流式细胞术（专栏 1）揭示了TP53突变和基因组不稳定的癌症中不同成纤维细胞和肌成纤维细胞群的富集；然而，这些协会的性质尚不清楚。上述Perturb-map筛选显示，Tgfbr2敲除产生了以TGFβ激活的成纤维细胞和T细胞排斥为特征的纤维粘液基质。另一个影响癌症演变的细胞外在和环境因素是缺氧，肿瘤中经常出现局部缺氧。它已被确定为不良结果的标志，并且已被证明可以选择某些突变，例如TP53。最近一项结合 scRNA-seq和免疫荧光的研究发现，缺氧微生态位含有对T细胞攻击有抵抗力的静止癌细胞。最后，空间基因组学还可以阐明不同的癌症亚克隆如何相互作用。在异种移植中观察到的克隆合作的报告至少要追溯到1989年。此后，克隆合作的要素被描述为涉及直接和微环境介导的相互作用。因此，全面绘制基因组进化、亚克隆特异性基因表达和TME的能力可能会进一步阐明这一现象的全部范围和机制。
4.3 播散性肿瘤细胞、转移性生态位和向器官性转移由播散性肿瘤细胞(DTC)播种。确定任何给定DTC是否存活、进入休眠状态或形成转移的机制尚不清楚，但很明显，这些细胞可以利用各种现有的细胞相互作用和空间微环境。例如，传播被证明取决于与昼夜节律相关的环境触发因素。在乳腺癌中，与中性粒细胞物理相关的DTC显示出更具侵袭性的表型。此外，已经描述了DTC和巨噬细胞的聚集甚至融合，进一步说明转移性传播也可能依赖于一系列细胞相互作用。向器官性的存在，即某些癌症类型和特定分子改变表现出不同的转移器官受累模式，已得到充分证实，并且通常根据Stephen Paget提出的经典种子和土壤假说来考虑，该假说假定某些组织提供易感的宿主环境特定肿瘤类型（图 4c）。向器官性似乎主要取决于原发肿瘤的起源细胞、DTC与转移宿主环境相互作用的能力以及某些靶器官（例如结直肠癌中的肝转移）的解剖学接近程度。在乳腺癌中，脑转移被证明是通过与谷氨酸能神经元的相互作用而促进的，并且在原发性脑癌中也观察到类似的模式，其中肿瘤细胞通过突触与正常星形胶质细胞形成网络。小鼠模型中的谱系追踪研究进一步支持了原发肿瘤中细胞群的内在和微环境特征影响转移率的观点。然而，基因组元素也出现了。最近对10种癌症类型的25,000例转移灶进行的泛癌分析揭示了同一原发肿瘤类型中57种器官趋化性的遗传关联。尽管许多基因组改变的存在与多器官转移率增加有关，但也有一些基因组改变与负担减轻相关的例子，例如，RBM10突变在肺癌脑转移中不太普遍。然而，值得注意的是，这些遗传模式似乎主要特定于某些原发肿瘤部位，而不是靶向部位。一系列研究报告称，肿瘤主要靶向组织以创建转移前壁龛，从而促进定植和转移生长。这发生在DTC通过可溶性因子和原发性肿瘤释放的细胞外囊泡到达之前或之时，这些囊泡可以改变全身免疫反应并诱导靶器官中血管和基质重塑的局部区域。此外，DTC可以进入休眠壁龛，促进长期生存甚至逃避治疗。在前列腺癌中，DTC可以与造血干细胞竞争占据已建立的骨内壁，而在骨骼、肺和脑中观察到血管周围壁龛。在黑色素瘤中，据报道，成纤维细胞的年龄依赖性变化会诱导肺部沉积物从休眠中苏醒。同样，在黑色素瘤小鼠模型中，发现淋巴结转移促进免疫逃逸并促进远处器官的进一步转移。由于所有这些现象都涉及细胞和空间相互作用，因此空间基因组学、转录组学和蛋白质组学分析可能会进一步深入了解这些过程。
5. 转化机会
如前几节所述，空间基因组方法对塑造不断发展的癌症生态系统的细胞组成、组织和相互作用产生了丰富的见解。对于任何给定的癌症，基因组都带有其独特的、过去的进化旅程的伤痕；然而，临床干预旨在塑造未来的病程（图 5）。因此，癌症治疗的一个主要希望是可以利用进化特征来更好地预测临床轨迹。因为肿瘤进化是一个空间过程，空间分辨特征可以提供额外的方法来预测结果。此外，更好地了解生态系统内的细胞相互作用可能会发现潜在的治疗漏洞，可以利用这些漏洞来控制进化过程。初步研究暗示了这些方法为新生物标志物发现、理解遗传亚克隆结构的临床相关性以及通过加深对人类样本和临床前动物模型中细胞相互作用的理解确定治疗漏洞提供的机会。
5.1 空间生物标志物发现空间生物标志物通过利用有关细胞组织或细胞间关系的信息来预测临床结果。在最简单的形式中，这种方法可以测量某种细胞类型相对于另一种细胞类型的分布。这是常用的基本概念，对肿瘤或间质隔室内的三级淋巴结构或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)进行组织形态学评分（图 3c）。间质TIL与三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤的良好预后和对化疗或免疫检查点抑制剂的反应相关。然而，就孤立而言，TIL作为生物标志物的可靠性受到异质性和不可重复性的阻碍。最近使用高度多重、原位、基于蛋白质组学的分析的研究已经开始通过表征TIL亚型、表达、细胞共定位和邻域模式来剖析这种复杂性，确定具有预后意义的TIL相关模式。一般来说，需要进行面对面的临床试验来确认与PDL1免疫组织化学等单一生物标志物相比，多重生物标志物是否具有额外的预后和预测价值。值得注意的是，免疫评分(Immunoscore)e是一种基于数字病理学的检测方法，可测量肿瘤核心和浸润边缘的CD3+和CD8+淋巴细胞密度，并已被证明在无病生存预测方面优于临床分期系统，表明更高维度的数据集可用于临床变革性的。除了在改进基于组织学的生物标志物方面的作用外，空间组学方法还可以促进从头发现生物标志物。两项乳腺癌研究（在“绘制癌症生态系统”一节中讨论）证明了这一点，这些研究使用机器学习算法从多重蛋白质组学和形态学数据中提取了复发性细胞群落。多重组织成像的另一个用途是卵巢癌研究，该研究发现耗尽的 CD8+ T细胞、PDL1+巨噬细胞和 PDL1+肿瘤细胞的相互作用与治疗反应相关。在这些研究中，检测具有临床意义的特征的能力源于这样一个事实，即可以使用组织微阵列以高通量分析数百个样本。然而，权衡是仅对主要肿瘤块的一小部分进行了取样（直径为0.6–0.8毫米的核心针活检），而浸润性边缘和间质大部分未取样。空间分子分析的一个重要下一步是在组织范围和单细胞分辨率下推导出典型癌症生态系统的目录。这些参考集可以作为设计更有针对性的研究的基础，这些研究可能会利用低复杂度、高通量或合理的二次抽样方法。组学数据的可扩展性和可重复性将是在大规模临床研究中成功实施的关键因素。
5.2 临床相关亚克隆个性化医疗的一个悬而未决的问题是如何处理可被抗肿瘤治疗靶向的亚克隆驱动突变。通过整合额外的空间数据层，可以建立空间背景，从而建立亚克隆改变的临床相关性43,208（图 5）。例如，原发性乳腺癌手术后进行的全身治疗针对的是隐性转移性疾病，目的是在转移沉积物有机会形成之前消除这些细胞。由于我们不能直接测定播散的肿瘤细胞，因此治疗范例基于原发肿瘤的特性。可以合理地假设浸润性癌症内的亚克隆突变也可能由播散的肿瘤细胞携带并可能驱动转移形成。相比之下，如果突变完全局限于前体病变，因此克隆甚至还没有表现出侵袭能力，我们可以相对确信它不会成为转移的驱动因素。整合空间转录组学或蛋白质组学数据可以进一步了解TME和亚克隆的基因表达特性。这种额外的表征将有助于推导特定亚克隆驱动突变的功能相关性的预测，例如通过考虑一系列内在和外在表型，包括血管侵犯或高风险TME生态位（图 5）。尽管需要进一步研究，但空间分析有可能用于早期检测设置或补充组织病理学确定的切除完整性，后者的应用为生物标志物驱动的手术和辅助放疗临床试验提供了机会。
5.3 临床前研究尽管空间基因组分析能够重建进化的过去和预测临床未来，但动物模型中的空间基因组实验可以为特定癌症相关突变的作用或癌症TME的空间方面的影响添加直接的机制证据。此类实验有望为细胞内在过程中扰动的细胞外后果提供临床上重要的见解，并为发现生物标志物提供许多机会。一种特别令人兴奋的方法是将空间分析与体内CRISPR筛选相结合。使用这种方法，可以在单个动物中同时研究数十个遗传上不同的克隆的细胞内在表型和局部TME关联，从而深入了解导致遗传差异克隆的不同临床命运的精确机制，这些克隆具有许多遗传基因和宿主特征。这些模型可以引领开发泛生态系统治疗策略的方式，这些策略同时针对细胞固有的脆弱性并利用TME的特性来试图终止癌症进化。
6. 结论和未来展望
虽然人们普遍认为致癌的群体遗传学可以用体细胞进化来很好地描述，但该过程的时空细节尚不完全清楚。关于细胞与TME的相互作用和微解剖限制影响癌症进化的程度，仍存在悬而未决的问题。随着空间基因组学、转录组学和蛋白质组学技术的出现，这种情况开始发生变化，这些技术可以绘制不同亚克隆的生长模式图，并表征其微环境的组成和结构。因此，将这些不同水平的肿瘤内异质性联系起来是理解肿瘤如何生长的关键，因为它揭示了肿瘤亚克隆如何与其微环境相互作用，以及这可能如何导致攻击性特征的选择。尽管存在各种具有不同优点和缺点的技术，但细胞分辨率对于理解癌症生态系统的微观解剖结构和将分子信号定位到特定细胞至关重要。绘制细胞如何在空间上组织成亚克隆和邻域以及不同细胞如何相互作用是理解scRNA-seq 研究目录揭示的转录多样性的关键步骤。另一个考虑因素是视野。典型的原发肿瘤在诊断时直径超过厘米；因此，需要能够绘制整个肿瘤切片的技术。最后，实现具有单核苷酸分辨率的空间分辨基因组学对于绘制亚克隆景观非常重要。虽然空间转录组学和蛋白质组学方法正在走向成熟并可作为商业平台使用，但空间基因组学却落后了。一个原因是每个细胞的DNA数量有限，而RNA和蛋白质的拷贝数要多得多，后者可能由仅包含部分细胞核的组织切片混合而成。尽管可以使用低覆盖度DNA测序甚至RNA测序来计算拷贝数变化，但估计系统发育关系和距离仍然具有挑战性。开发计算方法，例如整合数学建模、数学肿瘤学和基于人工智能的算法可能有助于克服这些挑战并产生进一步的定量见解。尽管存在这些挑战，但空间癌症基因组学的机遇是巨大的。绘制具有克隆分辨率的肿瘤生态系统以及TME的细胞和分子细节将具有很大的价值。在整个肿瘤切片和癌症类型上这样做将创建有见地的地图集，这些地图集不仅提供癌症成分的快照，而且还提供对过去肿瘤演变的见解。除了更详细地了解肿瘤生长之外，这些图谱还有可能揭示微环境被肿瘤细胞吸收的机制以及免疫系统如何抑制肿瘤增殖。这些过程已经被免疫检查点抑制剂利用，增强的分子和空间细节可能会产生更多的治疗目标或促进更有效地使用现有疗法。此外，空间生物标志物的推导和空间基因组学诊断应用的检测可能会为治疗提供信息；现在尤其如此，因为空间基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学方法开始用于临床试验。需要这种多模式方法来阐明TME的内在复杂性——其结果将是一场组织病理学的革命，它是基因组学和分子学的信息。因此，各种单细胞和空间分辨分析的可用性以及这些方法提供的新兴见解需要新的协同努力。癌症基因组图谱和国际癌症基因组联合会等先前的倡议已经创建了宝贵的社区资源，详细介绍了癌症的分子和基因组特性。因此，人类肿瘤图谱网络等新兴项目似乎很自然地遵循这种精神，以创建下一代分子解析的癌症图谱。
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