科研 |中国中医科学院&中科院遗传发育所：中药复方水提物通过引起DNA损伤抑制HeLa细胞增殖(国人佳作)

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编译：微科盟-草重木雪，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

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导读

复方杠柳（FFGL）是治疗由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起的疣增殖的有效配方，具有治疗HPV相关癌症的潜力。然而，它对宫颈癌（HPV引起的最常见癌症）的抗肿瘤活性缺乏科学证据。本研究旨在阐明FFGL水提取物对人宫颈癌的抗肿瘤作用及其在HeLa细胞中细胞周期阻滞的可能机制。我们使用CCK-8测定法评估FFGL对宫颈癌细胞的抗增殖作用；使用流式细胞术测定凋亡细胞的比例、细胞周期分布和细胞分裂率。定量蛋白质组学用于鉴定FFGL处理后的差异表达蛋白，生物信息学分析用于鉴定受FFGL影响的关键节点蛋白。免疫荧光和蛋白质印迹分析用于探索细胞周期和DNA损伤途径中相关蛋白表达的变化，以阐明FFGL对HeLa细胞增殖的潜在作用机制。FFGL抑制宫颈癌细胞增殖，导致细胞周期阻滞。根据定量蛋白质组学，CyclinB1可能在FFGL对HeLa细胞的抗增殖作用中发挥重要作用。其他实验表明，FFGL水提取物引起共济失调毛细血管扩张突变（ATM）介导的DNA损伤，进一步磷酸化CHK2，导致Cdc25C失活，抑制CDK1/CycinB1复合物的活性，并导致细胞周期停滞。FFGL能抑制宫颈癌细胞增殖。此外，它可以增加CDK1磷酸化，通过引起DNA损伤阻断细胞周期，并抑制HeLa细胞增殖。

亮点：1. 复方杠柳水提取物抑制宫颈癌细胞增殖；2. 复方杠柳水提取物抑制HeLa细胞CDK1活性；3. 复方杠柳水提取物通过DNA损伤阻断HeLa细胞的细胞周期；4. 复方杠柳水提取物对宫颈癌有治疗潜力。

论文ID

原名：Fu Fang Gang Liu aqueous extract inhibits the proliferation of HeLa cells by causing deoxyribonucleic acid damage译名：复方杠柳水提物通过引起脱氧核糖核酸损伤抑制HeLa细胞增殖期刊：Journal of EthnopharmacologyIF：5.195发表时间：2022.12通讯作者：崔炳南、孟文翔，樊竹通讯作者单位：中国中医科学院广安门医院 & 中国科学院遗传与发育生物学研究所

实验设计

实验结果

1. FFGL中的成分分析
我们通过UPLC-MS/MS分析检测FFGL水提取物中的化学成分，并使用Compound Discovery软件进行成分分析。我们在总正离子（图1a）和负离子（图1b）离子色谱图（补充表1）中共鉴定了151种化学成分。表1显示了前15个主要成分。表1 FFGL的前15个主要成分
图1 FFGL的总离子色谱法（a）正离子模式下FFGL的基峰离子色谱。（b）负离子模式下FFGL的基峰离子色谱。
2. FFGL抑制子宫颈癌细胞增殖
HPV16和HPV18是最常见的可导致宫颈癌的高危HPV类型。为了检查FFGL对人宫颈癌细胞系的影响，实验中使用了三种宫颈癌细胞株（HeLa，HPV18阳性；SiHa和Caski，HPV16阳性）。我们使用CCK-8方法检测FFGL对三种细胞系的影响。在初步的预实验中，我们发现用5120 μg/mL的FFGL处理细胞72小时几乎完全抑制了宫颈癌细胞的细胞活力；因此，我们选择了0–5120 μg/mL的浓度范围进行细胞活力实验。根据细胞活力测定曲线，FFGL以时间和剂量依赖的方式显著抑制HPV阳性HeLa、SiHa和Caski细胞系的活性（图2a）。在FFGL对三种高危HPV阳性细胞系的抗增殖作用中，对HeLa细胞的抑制作用最为显著。因此，我们选择HeLa作为主要研究目标。使用显微镜，我们观察到FFGL导致HeLa细胞数量显著减少，并通过计数细胞数量证实了这种减少（图2b和c）。图2 复方杠柳（FFGL）对宫颈癌细胞的抗增殖作用（a）HeLa、SiHa和Caski细胞系用不同浓度的FFGL处理24、48和72小时，并使用CCK-8方法测定细胞活力。（b）在显微镜下观察不同浓度的FFGL处理后HeLa细胞的形态学。比例尺：20μm（c）HeLa细胞用不同浓度的FFGL处理48小时，通过细胞计数确定细胞数量。与对照组相比，***P<0.001；平均值±SEM；n＝3。
3. FFGL引起细胞周期停滞，但没有明显的凋亡
FFGL显著减少HeLa细胞的数量，这可能归因于FFGL诱导的HeLa细胞增殖减少和凋亡增加。我们选择160μg/mL（48小时IC50）作为后续实验的药物浓度。特别是，根据细胞活力测定曲线，我们得出结论，FFGL干预的生物效应在48 h时已经稳定，我们后续实验的干预时间都在48小时内。因此，我们认为48小时的IC50是后续使用的合适药物浓度。首先，我们测试了FFGL对HeLa细胞凋亡的影响。160μg/mL FFGL处理24小时和48小时增加了坏死细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的数量（图3a和b）。然而，进一步分析显示，FFGL处理导致的凋亡细胞总数少于10%，这不足以将细胞数量减少50%以上。此外，FFGL处理Hela细胞24小时和48小时没有诱导凋亡生物标志物Caspase 3的激活（补充图S1）。因此，我们认为FFGL引起的HeLa细胞凋亡增加不是细胞数量减少的主要原因。随后，我们研究了FFGL对HeLa细胞周期分布的影响。我们发现，与对照组相比，用160μg/mL FFGL处理HeLa细胞24小时后，G2/M期分布的细胞数量显著增加。此外，在处理48小时后，分布在S期的细胞数量显著增加（图3c）。随后，我们使用CFSE细胞增殖试剂盒检查160μg/mL FFGL对HeLa细胞增殖率的影响（图3d和e）。处理后24小时和48小时，FFGL组的荧光强度高于对照组。此外，增殖指数表明，FFGL组在24 h时的增殖率低于对照组（P<0.05），48 h时的降低更为显著（P<0.001）。因此，FFGL可能导致HeLa细胞S期和G2/M期阻滞，并降低细胞分裂速率，这可以解释HeLa细胞数量减少的原因。图3 复方杠柳（FFGL）在G2/M和S期引起HeLa细胞周期阻滞，并导致最小的凋亡（a）将HeLa细胞暴露于160μg/mL FFGL 24和48小时，并使用Annexin V-FITC/PI染色使用流式细胞术分析细胞凋亡。（b）凋亡细胞的统计分析。（c）将HeLa细胞暴露于160μg/mL FFGL 24和48小时，并使用流式细胞术分析细胞周期分布。显示G0/G1、S和G2/M期细胞的百分比。（d）将HeLa细胞暴露于160μg/mL FFGL 24和48小时，并使用CFSE染色通过流式细胞术分析细胞增殖率。（e）细胞增殖指数的统计分析。与对照组相比，*P<0.05，***P<0.005，***P<0.001；平均值±SEM；n=3。
4. 蛋白质组学分析显示CyclinB1是PPI网络的核心节点
我们使用定量蛋白质质谱分析来探索FFGL的抗肿瘤机制，随后鉴定了7231种蛋白质。与未处理的细胞相比，FFGL处理的细胞在处理6小时后含有483个DEPs（图4a）。483个DEPs中，288个下调，195个上调（图4b）。补充表2显示了已识别DEPs的完整列表。随后，我们分析了这些DEPs的功能富集。GO分析显示，FFGL干预改变了“生物过程”、“细胞成分”和“分子功能”中几个术语的表达。在这里，我们按照统计学意义的顺序展示了FFGL显著影响的生物学过程、细胞成分和分子功能（P<0.01）（图4c）。FFGL暴露最受影响的生物过程包括核糖核酸聚合酶II启动子翻译的负调节、核糖核酸聚合酶Ⅱ启动子翻译正调节、翻译负调节、DNA模板转录起始和蛋白质光合作用。受影响的细胞成分是核质、细胞质、细胞核和细胞质。与FFGL暴露相关的分子功能是蛋白质结合、DNA结合、染色质结合和微管结合。补充表3列出了受FFGL处理严重影响的GO类别及其相应的蛋白质名称的完整列表。接下来，我们使用KEGG富集分析来确定FFGL处理细胞中的DEPs，以更好地了解这些DEPs影响的信号通路。我们确定了19条显著富集的途径（P < 0.05），并根据统计显著性对其进行了排序（图4d）。DEPs主要在细胞周期、人类免疫缺陷病毒1感染、FoxO信号通路、细胞感觉和其他信号通路中富集。补充表4显示了受FFGL处理显著影响的KEGG途径和相应蛋白质的名称。为了进一步了解DEP之间的相互作用，我们在STRING中构建了这些蛋白质的PPI网络，并使用Cytoscape将其可视化（图4e）。我们去除了与其他蛋白质不相连的蛋白质，以更清晰地显示结果。使用DEP构建的网络具有132个节点和257个边缘。圆的大小表示度数值。CyclinB1是PPI网络中度值最高的节点和核心节点，表明CyclinB1可能在FFGL的抗肿瘤机制中发挥重要作用。补充表5显示了PPI网络中节点的详细信息。图4 复方杠柳（FFGL）处理后HeLa细胞差异表达蛋白（DEP）的生物信息学分析（a）DEP火山图。（b）DEP热图。（c）基因本体（GO）——DEP的丰富条目。（d）京都基因和基因组百科全书（KEGG）-丰富了DEP条目。（e）DEP的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。
5. FFGL增加了CDK1的非活性形式，这可能与DNA损伤有关
CyclinB1是一种重要的细胞周期检查点蛋白。其主要功能在与CDK1结合后被激活，随后进入细胞核并激活下游底物，促进细胞周期从G2期到M期。由于这一过程涉及细胞内定位的转换，我们使用免疫荧光染色观察了FFGL暴露后CyclinB1和CDK1的分布。与对照组细胞相比，用160μg/mL FFGL处理的HeLa细胞在细胞核周围表现出CDK1-CcyclinB1聚集（图5a）。图5 复方杠柳（FFGL）增加CDK1的非活性形式（a）FFGL暴露3h后，使用免疫荧光观察CyclinB1和CDK1的细胞内分布。比例尺：20μm。（b）检测pCDK1（Y15）、总CDK1、CyclinB1、CyclinA2和CyclinE1的表达。（c）pCDK1/CDK1比值的统计分析。（d）CyclinB1/β肌动蛋白、CyclinA2/β肌动蛋白和CyclinE1/β肌动蛋白比值的统计分析。与对照组相比，*P<0.05。平均值±SEM；n＝3。
随后，我们回顾了CyclinB1-CDK1复合物的功能过程。当细胞从S期过渡到G2期时，CDK1与CyclinB1结合，复合物中CDK1的Y15保持磷酸化以保持其活性。当细胞准备从G2期进入M期时，Y15去磷酸化，CyclinB1-CDK1复合物活性启动。随后，复合物进入细胞核并促进有丝分裂。我们观察到160μg/mL FFGL暴露后Y15处CDK1的磷酸化，Y15磷酸化水平随时间显著增加（图5b和c），表明FFGL导致CDK1非活性形式的增加，从而使CyclinB1-CDK1复合物失活。然而，我们在CyclinB1表达中没有观察到显著差异（图5b和d）。我们还检测到CyclinA2和CyclinE1在其他周期阶段的表达，并发现FFGL不会导致这些周期蛋白表达的显著差异（图5b和d）。结果表明，FFGL处理导致CDK1-CcyclinB1复合物在细胞核周围聚集，这可能与Y15处CDK1的磷酸化增加有关。随后，我们进一步探讨了FFGL导致这一变化的原因。磷酸激酶和磷酸酶调节Y15的磷酸化，磷酸激酶Wee1磷酸化Y15残基使其失活。同时，磷酸酶Cdc25C使Y15残基去磷酸化，激活CDK1，使CDK1-CcyclinB1复合物进入细胞核并促进有丝分裂。我们发现，在160μg/mL FFGL干预后，HeLa细胞中pCdc25C（Cdc25C的非活性形式）的水平显著增加（图6a和b），Wee1蛋白的表达呈上升趋势（图6a和c）。这些结果表明，Y15处CDK1磷酸化的增加可能与Cdc25C的失活有关。图6 复方杠柳（FFGL）导致Cdc25C非活性形式的增加（a）Wee1、pCdc25C（S216）和总Cdc25C的表达。（b）pCdc25C/Cdc25C比值的统计分析。（c）Wee1/β-actin比值的统计分析。与对照组相比，*P<0.05。平均值±SEM；n＝3。
磷酸酶Cdc25C的失活可能与DNA损伤有关。因此，我们进一步研究了DNA损伤途径的标记蛋白。我们发现，FFGL暴露增加了pCHK2和pATM水平，但不影响pCHK1和pATR（图7a和b）。此外，我们还检查了FFGL干预4 h时DNA损伤标记蛋白含量和磷酸化程度的变化（补充图S2），观察到蛋白质变化趋势与FFGL干预3 h时的变化趋势相当。接下来，我们通过彗星试验检测DNA损伤。与对照组相比，FFGL干预后3小时和12小时Hela细胞尾部和尾矩中的DNA百分比（%DNA）显著增加（图7c和d），并显示出时间依赖性效应，表明FFGL干预导致DNA损伤。图7 复方杠柳（FFGL）处理导致的DNA损伤（a）pCHK1、CHK1、pCHK2、CHK2、pATM、ATM、pATR和ATR的表达。（b）统计计算pCHK1/CHK1、pCHK2/CHK2、pATM/ATM和pATR/ATR的比值。彗星试验用于分析DNA损伤。（c）不同时间点的代表性图像。比例尺：100μm。（d）使用OpenComet对尾部和尾矩的DNA含量进行了定量。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005，***P<0.001。平均值±SEM；n＝3。

讨论

该研究证实，FFGL抑制宫颈癌细胞的增殖，DNA损伤诱导的CDK1活性抑制可能是一种重要机制（见图8）。

图8 复方杠柳（FFGL）的HeLa细胞增殖抑制模型FFGL水提取物导致DNA损伤，使ATM/CHK2活化，诱导Cdc25C失活，进而抑制CDK1活性，使细胞周期停滞，最终抑制HeLa细胞的增殖。

然而，据报道，FFGL中存在的小分子可导致许多肿瘤细胞系的凋亡；因此，应首先研究这种效应是否由细胞凋亡增加介导。我们的结果表明，在用更高的FFGL药物浓度处理后，HeLa细胞发生一定程度的凋亡；然而，凋亡细胞的数量不足以解释观察到的细胞数量减少。因此，我们认为，除了细胞凋亡，其他因素可能有助于抑制细胞增殖。因此，进一步的实验表明，FFGL在S期和G2/M期阻断HeLa细胞。

蛋白质组学是鉴定中药有效靶点的重要研究方法。通过蛋白质组学筛选的DEP的生物信息学分析表明，FFGL主要影响细胞周期、人类免疫缺陷病毒1感染和其他途径。在富集的途径中，FFGL显著影响细胞周期途径，这与我们先前的细胞周期阻滞研究结果一致。我们认为，FFGL对人类免疫缺陷病毒1感染和其他免疫途径的影响非常重要。一项临床研究发现，FFGL可以抑制HPV感染引起的疣复发。考虑到FFGL中的药物成分具有免疫调节作用，我们推测FFGL也可能影响相关的免疫系统，这需要进一步研究。PPI网络提供了一个基于蛋白质之间相互作用识别核心调控基因的平台。我们的PPI分析显示CyclinB1的富集程度最高，表明其在FFGL诱导的HeLa细胞增殖抑制中的作用。

肿瘤细胞最具特征的特征之一是其不受调控和无限期分裂的能力。因此，细胞周期调控被认为是肿瘤治疗的有效策略。CyclinB1是一种主要通过与CDK1结合来调节G2或M期的细胞周期蛋白。CyclinB1和CDK1的免疫荧光染色显示，FFGL可以阻断细胞核周围的CyclinB1与CDK1。进一步分析显示，FFGL处理后CDK1活性显著降低。

CDK1是哺乳动物细胞中唯一必需的细胞周期CDK蛋白，在细胞周期调节中起着关键作用。在肿瘤细胞中，CDK1活性通常异常升高；事实上，它已经在宫颈癌组织中检测到。异常CDK1的激活使细胞逃离细胞周期检查点，导致细胞增殖，最终形成肿瘤组织。因此，CDK1是癌症治疗的潜在靶点。目前已经开发了多种CDK1抑制剂用于癌症治疗。这些抑制剂与DNA损伤剂结合可以延长G2期，并作为敏化剂。在我们的研究中，Y15处CDK1的磷酸化程度显著增加，表明CDK1活性受到抑制。Cdc25C和Wee1调节Y15的磷酸化。因此，我们测量了这两种酶的活性，发现Cdc25C的非活性形式显著增加，这是DNA损伤的常见结果。

内部或外部应激通常会导致细胞内的DNA损伤。为了防止DNA损伤，细胞已经开发出一种复杂但有序的系统来修复损伤或移除无法修复的细胞，称为DNA损伤反应（DDR）。不同类型的DNA损伤可导致特定信号传导和修复级联的激活。ATM和ATR是DDR级联的起始激酶。ATM主要由双链断裂（DSBs）激活，这是对细胞最致命的DNA损伤形式之一，而ATR主要对复制停滞做出反应。为了向下游转导DNA损伤信号，ATM和ATR分别磷酸化下游转导激酶CHK2和CHK1，调节细胞周期控制检查点并迫使细胞周期停滞。为了确定FFGL是否导致DNA损伤，我们测量了DDR标记的表达。暴露于FFGL后CHK2和ATM的磷酸化程度显著增加，表明干预导致DNA损伤。虽然本研究中使用的FFGL剂量诱导了DNA损伤，但并未导致细胞凋亡的显著增加。这可能与DNA损伤的程度有关。总之，我们的结果表明，FFGL通过引起DNA损伤来增加CDK1磷酸化，从而导致细胞周期停滞和细胞增殖抑制。

根据细胞周期测定的结果，FFGL主要在干预24小时后阻断G2/M期的细胞周期。这与我们的后续结果一致，因为我们后续实验的干预时间在24小时内。相反，FFGL作用48小时后，细胞主要在S期阻滞，这也可能是由于DNA损伤。这是因为DNA损伤也激活S内检查点，通常是ATR-CHK1通路激活的结果。一些结果表明，ATR活化可能依赖于ATM活化，因为ATR活化是通过复制蛋白A和单链DNA复合物等常见中间体的产生而发生的，而不是通过识别DNA损伤本身。该路线可能具有时间顺序，可在进一步研究中探索。

正如我们前面提到的，由于DDR的缺陷，诱导DNA损伤的治疗方案对HPV阳性肿瘤细胞非常敏感，我们认为FFGL可能在宫颈癌或宫颈癌前病变的辅助治疗中具有潜在的应用。

虽然我们获得了有趣的结果，但我们必须强调这项研究的局限性。我们关注了FFGL如何影响CDK1磷酸化，但不排除FFGL可能以其他方式减缓细胞生长的可能性。因此，我们应更加重视本研究的完整性和全面性。此外，我们的研究主要针对宫颈癌细胞系HeLa。对多个宫颈癌细胞系的研究有助于揭示FFGL在宫颈癌中作用的整体图像。

结论

FFGL抑制CDK1活性，通过引起DNA损伤阻断细胞周期，抑制HeLa细胞增殖。

原文链接：  https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36584921/

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