新的 m6A 识别蛋白 MOV10
分享一篇 m6A 文献，目前还在预印本上面，还没发表。
文章标题：
筛选出一个新的 m6A 识别蛋白 MOV10，能够以 m6A 依赖的方式 降解 含有 m6A 修饰的 mRNA 来 维持小鼠胚胎干细胞的状态 。
接下来从背景、结果、讨论等方便进行介绍。
1、背景
m6A 在真核生物里 mRNA 和 lncRNA 上都有广泛的修饰，并且是一个动态变化的过程。m6A 修饰参与了 RNA 的转运、剪接、稳定、降解、翻译等多种生物学过程。
高通量测序结果发现 m6A 修饰主要位于 stop codon 和 3'UTR 位置附近，存在一个保守的 R（A/G）R（A/G）ACH（A/C/U）的基序。
m6A 修饰主要被甲基化酶转运复合体 METTL3、METTL14 和相关的亚单元 WTAP、KIAA1429 和 ZC3H13 甲基化，被去甲基化酶 FTO 和 ALKBH5 进行去甲基化。此外还可以被 m6A 的识别蛋白（m6A readers） 结合发挥不同的生物学功能，例如 YTHDF（YTHDF1-3）家族，YTHDC（YTHDC1-2）家族、IGF2BP（IGF2BP1-3）家族，HNRNP 家族，在翻译、RNA 稳定性、降解、剪接等方面发挥作用。
目前大部分研究都主要集中在已知的 m6A 蛋白身上，作者为了研究 m6A 修饰在小鼠胚胎干细胞中的作用寻找到了新的 m6A 识别蛋白，并研究了起机制。
2、结果部分
如何发现新的识别蛋白？
作者采用了 RNA-pulldown 实验结合蛋白质谱技术，通过含有 3 个 m6A 修饰 的基序重复序列的 单链 RNA 探针 拉到了很多 m6A 识别蛋白。其中拿没有 m6A 修饰的探针作为对照实验。
对结果进行分析发现很多经典的识别蛋白也被成功捕获，同时发现了一个新的识别蛋白 MOV10 ，WB 结果看到这些识别蛋白更会优先结合 m6A 修饰的 RNA。
MOV10 结合的哪些 RNA？
作者为了探究 MOV10 结合了哪些 RNA，对 MOV10 做了 RIP-seq，同时在 mESC 中做了 m6A-seq，分别鉴定到 5808 和 4953 个 peak，可以看到 MOV10 结合的位置主要是 CDS 和 3'UTR 区：
RIP-seq 和 m6A-seq 的 overlap 有 2155 个重合的 peaks：
可以认为这些是 MOV10 结合 m6A 修饰的靶标，作者称为：MOV10+m6A targets 。那些含有不含有 m6A 修饰但被结合的称为：MOV10-m6A targets。
MOV10 结合靶标和 m6A-seq 结果类似
作者针对 2155 peaks 与 m6A-seq 结果比较分析，发现两种在 整体结合 pattern 还是 单个基因上的模式 相似：
作者还比较了2155 peaks 和非 7764 个 MOV10 结合的序列的富集 motif 基序，发现只有 MOV10 结合的 m6A 修饰的序列表现出 GGACU motif 的富集：
小结：
通过以上实验验证发现 MOV10 是一个 m6A 结合蛋白，能选择性的结合含有 m6A 修饰的 RNA。
MOV10 的生物学功能？
MOV10-KO 细胞系构建
为了进一步探索 MOV10 在 mESC 中的功能，作者构建了crispr MOV10 基因的敲除 mESC 细胞系，WB 和免疫荧光验证 MOV10 基因敲除的很干净 ：
MOV10-KO m6A-seq
随后作者比较了 MOV10 基因 在 KO 条件下的 MOV10 结合的 m6A 修饰的靶标基因的 m6A 水平变化，通过 KO 以后的 m6A-seq 数据分析，发现相比较非 MOV10 靶标基因而言，在 MOV10 基因敲除后，MOV10 结合 m6A 修饰的靶标（2155）的 m6A 水平发生了显著下降：
作者还对 MOV10 所有结合的 peaks 在 MOV10 KO 以后检查了 m6A 水平变化，发现并没有多大变化，暗示 MOV10 只调控其结合 m6A 修饰的靶标基因：
MOV10-KO 的 RNA-seq 也显示只有 2155 那些靶标才有显著性变化：
MOV10 是否在转录后调控其靶 mRNA？
为了进一步研究 MOV10 在哪一过程调控其靶标发挥作用，作者做了 半衰期实验 和 翻译效率实验 。
发现在 MOV10 KO 以后，MOV10+m6A targets 的 半衰期显著增加 ，而其它两种并没有变化：
在 MOV10 KO 以后，MOV10+m6A targets，MOV10-m6A targets，MOV10 non-targets 翻译效率并没有变化：
Ribo-seq 质控图（片段分布、样本相关性、frame 分布、火山图）：
小结：
综合以上结果分析，MOV10 以 m6A 依赖的方式去降解或使其 mRNA 结合靶标不稳定。
MOV10 驱动降解的具体分子机制和结合靶标？
为了剖析 MOV10 结合靶点驱动降解过程的潜在分子功能，作者做了 MOV10 的 co-IP 实验，结合定量质谱检测，发现了一些与 MOV10 互相作用高置信度的互作蛋白。
GO 和 CC 富集分析发现这些富集到 mRNA 的加工、可变剪接、翻译、转运、稳定性和核糖核蛋白复合物、Pbody、多聚腺苷酸化特异性因子(CPSFs)复合物、剪接复合物等通路里：
实验验证也确实能看到 MOV10 定位在细胞质和细胞核里，其中包括 Pbody：
互作蛋白里主要包括：Pbody 蛋白、剪接因子、HNRNP 蛋白、RNA 结合蛋白等：
CPSFs, PABPC1, TUT4 与 mRNA 3'端加工，plolyA 长度有关， CPSFs, HNRNPs和剪接因子与剪接有关，这些都与 MOV10 互相作用，作者检测了 ployA 长度和 m6A 基序富集的剪接情况，发现都没有差异，并不能与 MOV10 驱动降解联系起来：
然后作者猜测可能是通过无义介导的mRNA降解机制（ nonsense-mediated mRNA decay (NMD)）来介导的，因为 MOV10 与 UPF1 蛋白有很强的互作性。
无义介导的 mRNA 降解机制：
无义介导的 mRNA 降解(nonsense-mediated mRNA decay，NMD）作为真核细胞中重要 RNA 监控机制，识别并降解开放阅读框中含有提前终止密码子（premature termination codon，PTC）的 mRNA，以避免因截短的蛋白产物积累对细胞造成毒害. NMD 还调控正常生理基因的表达，暗示其在真核细胞中扮演重要角色. NMD 途径的关键是 PTC 的识别。NMD 通常由 NMD 因子 UPF1（up-frameshift）等被招募至含 PTC 的 mRNA 上，借助这些因子组装形成“功能复合体”并激活降解.但对于 PTC 识别后的过程仍认识有限。
MOV10 维持 Pbody 的完整性
MOV10 与很多的 pbody 蛋白互相作用，作者探究 MOV10 是否与 Pbody 的完整性有关。
EDC4 是 Pbody 的标记，免疫荧光显示 MOV10 和 EDC4 有很大一部分（93%）的 共定位和 点状结构 ：
然而在 NOV10 KO 后，点状结构显著减少。
小结
以上实验表面 MOV10 在 mESC 中维持 P body 的完整性。
结合 MOV10 促进降解和维持 Pbody 的完整性结果，作者推测 MOV10 只降解在 P body 中含有 m6A 修饰地 mRNA。
为了验证假设，作者做了 DDX6 的 RIP-seq（Pbody 的重要组成成分），发现与 MOV10 的 RIP-seq 结合 靶标大部分重叠 ，此外它们也有 高度的共定位现象 ：
此外还发现 89% 的 MOV10+m6A targets 与 DDX6-RIP-seq 重叠，命名为 MOV10+m6A+DDX6 targets ，57% 的 MOV10-m6A targets 与 DDX6-RIP-seq 重叠，命名为 MOV10- m6A+DDX6 targets ：
随后作者对这些不同的 gene sets 进行半衰期实验，发现 MOV10+DDX6 (4,009) 和 MOV10+m6A+DDX6 (1,914) targets 在 MV10 KO 后 半衰期显著增加 ，相反，MOV10 only targets (1,799) 在 MV10 KO 后 半衰期中等程度的下降，然而 MOV10-m6A+DDX6 targets (1,558) 和 MOV10 non-targets (7,764) 没有显著性的变化。
表示 MOV10 除了 降解其自身结合 m6A 修饰的 mRNA， 还包括 DDX6 结合的含有 m6A 修饰的 mRNA。
作者还验证翻译效率的变化，发现并没有显著变化：
小结：
综合以上结果表面，MOV10 介导了在 Pbody 的其结合的 m6A 修饰的降解过程。
细胞系表型
正常 mESC 细胞系的形态为圆形、圆顶形、呈3维形态生长，在敲除 MV10 以后，细胞形态变为扁平形，细胞接触减少，提示细胞已经 分化 或者 干性降低 。
引起表型变化的机制？
作者发现糖原合酶激酶-3ß(Gsk-3ß) 在 MV10 KO 后半衰期显著上升，而Gsk-3α (homologue of Gsk-3ß) 保持不变：
GSK-3s：
GSK-3s 家族功能报道为维持 mESC 的状态，GSK-3ß 能够维持 mESC 的自我更新。此外，抑制 GSK-3 可以通过稳定 ß-CATENIN 来激活经典的 WNT/ß-CATENIN 信号通路，后续激活下游靶标 NANOG 基因（ESC 细胞转录因子）。这条被认为是维持 mESC 状态自我更新的关键机制。
基于以上背景研究，在 MOV10 KO 的 mESC 细胞系中，GSK-3 是如何调控 NANOG 的表达的呢？
GSK-3ß 的 Ser9 磷酸化对于在 WNT/ß-CATENIN 通路中控制 ß-CATENIN 的降解非常重要。实验表示结果表明，在 Mov10 缺失的情况下，GSK-3ß Ser9 磷酸化的激活降低了 ß-CATENIN 的表达和 NANOG 的表达：
这就永久的导致了细胞的表型，干性降低。（这里 GSK-3ß 的蛋白水平并没有太大变化，作者猜测 GSK-3ß 的水平维持还基于其它的通路）
为了检测 MOV10 是否以 m6A 依赖的方式调控 Gsk-3ß mRNA 的降解，由 MOV10 KO 的 m6A-seq 数据分析结合 MOV10 KO 增加 Gsk-3ß 的半衰期可以得到证明：
值得注意的是，MOV10 KO 后 NANOG 的 m6A 水平显著下降，但是其半衰期并没有变化，提示 MOV10 不是以 m6A 依赖的方式调控 NANOG 的 mRNA，然而 MOV10 通过 WNT/ß-CATENIN 通路来调解 NANOG 的蛋白水平。
总结：
1、本文通过 co-IP 筛选出新的 m6A 结合蛋白，并使用 RIP-seq、m6A-seq、RNA-seq 实验进行验证。
2、为了探究其分子功能，构建了 WOV10 的 CRISPR 敲除基因，结合 m6A-seq、半衰期实验及 RIBO-seq、WOV10 的 co-IP 实验等等、验证 WOV10 以 m6A 依赖的方式破坏靶 mRNA 的稳定性或降解其靶 mRNA。
3、最终发现 MOV10 以 m6a 依赖的方式破坏/降解 Gsk-3ß mRNA，稳定 WNT/ß-CATENIN 通路的 ß-CATENIN 蛋白表达，以保持下游 NANOG 的表达以维持 mESC 的状态。
3、读后感
实验比较全面，结构清晰明了，需要有一定的背景知识。MOV10 与 UPF1 互作介导无义介导的 mRNA 降解机制可以需要通过实验进一步验证，内容可以更加完善。
收官！
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