前言
2021年2月9日，国内ADC药物排头兵百奥泰因临床效果不佳，宣布终止HER2 ADC药物BAT8001的三期临床试验，当日股价大跌18.73%，3月5日又终止了BAT8003（Trop-2单克隆抗体-美登素偶联物）的临床开发，预示着百奥泰研发投入近3亿元的ADC新药“全军覆没”。
然而国内的失败并不影响ADC行业高涨的热情，自2017年以来已有8款ADC产品上市，重磅并购频出，风物长宜放眼量，以ADC为代表的新技术将引领下一个十年的新药研发。本文将就ADC的作用机理、发展历程、ADC设计核心、上市产品、国内外产品管线布局及市场机会进行讨论风物长宜放眼量
ADC药物（Antibody–drug conjugates），即抗体偶联药物。ADC药物由单克隆抗体（antibody）、连接子（linker）和细胞毒性小分子药物（payload）三部分组成。小分子药物通过连接子连接至单抗，ADC药物依靠单抗对肿瘤细胞相关抗原的特异性和靶向性，到达肿瘤细胞，并通过内吞作用进入细胞，连接子在细胞内低PH值或溶酶体蛋白作用下断裂，释放出细胞毒素药物。ADC药物的出现填补了抗体药物和传统化疗药物之间的空白，提高了药物的特异性并改善了治疗窗口。
图1 ADC药物结构
ADC的初衷非常简单，就是使用特定载体将有效的载荷（payload）递送到靶点上去。ADC大多是通过静脉注射到血液中，以此来避免胃酸和蛋白水解酶降解mAb。理想情况下，独家靶抗原（在肿瘤细胞上表达，但在正常细胞中不表达），是ADC的mAb组件找到靶点和并结合靶点的先决条件。一旦抗体识别并结合靶点，ADC-抗原复合物就会通过受体介导的细胞内吞途径进入细胞。
图2 ADC药物作用机理
（i）网格蛋白介导的内吞作用（ADC进入细胞的主要途径）；其中前两种途径是抗原依赖型的，而细胞的胞饮途径却不依赖于抗原。ADC-抗原复合物内吞的速率和效率取决于靶点的类型和细胞毒性化合物。抗体和抗原之间较低的亲和力（Kd>10 nmol/L)可能会导致内吞的效率低下，停留在细胞外的ADC的脱靶释放，将会导致更严重的全身毒性问题。
内吞过程首先会导致细胞膜向内形成小泡，这个过程中会将质子传入早期内涵体中，从而为早期核内体提供了一个酸性的环境。一旦ADC的一部分与核内体中的FcRns结合并运送到细胞外去，细胞间质中生理条件下的pH值（pH=7.4）将会帮助ADC从FcRn受体上释放出来，导致细胞毒性。因此，此类缺乏Fc尾巴的ADC可能在ADC药物中更有优势。最后，ADC所在的早期核内体被转化为成熟核内体，然后与溶酶体结合，导致pH值进一步降低。溶酶体中的酸性环境和大量蛋白酶（比如cathepsin-B和plasmin）会切割ADC，将游离的细胞毒性弹头释放到细胞质中。这些细胞毒性弹头会干扰细胞机制，诱导细胞凋亡，最终导致细胞死亡。细胞死亡的途径取决于所用弹头的类型。例如，auristatins和maytansinoids通过干扰微管蛋白引起细胞凋亡，而calicheamicins和duocarmycins则通过嵌入DNA的方式诱导细胞死亡。
20世纪初诺贝尔奖获得者 Paul Ehrlich 首次提出“magic bullet”（魔术子弹）理论，即通过结合簇将药物送达肿瘤。这即为ADC的设计理念。但是受限于小分子药物及抗体均需要深厚的基础研究，连接子的结合稳定性亦是难以攻克的技术难题，ADC行业发展出现坎坷。1958年Mathe首次将抗鼠白细胞免疫球蛋白与甲氨蝶呤偶联用于白血病的治疗，推动了ADC概念的第一次进展。1975年英国剑桥大学科学家乔治斯•科勒 (GeorgesJ. F. Kohler)和赛瑟•米尔斯坦 (Cesar Milstein)共同发表了一篇关于抗体研究性论文，描述了一种能够大量生产单克隆抗体的杂交瘤技术，治疗性抗体药物的生产由此从理论逐渐变为了现实，同年开展了ADC动物模型试验。其后约10年，ADC药物在人体试验上首次成功取得了进展。20世纪90年代初，基于人源化和嵌合单克隆抗体的ADC被报道，其后直至2001年全球首个ADC药物辉瑞的Mylotarg经FDA批准上市，用于治疗CD33靶点的急性髓系白血病。2004年Mylotarg的III期研究启动，发现因其具有致命的肝损伤，辉瑞于2010年主动申请将其退市，这就是第一代ADC药物。
图3 ADC药物发展历程
与第一代ADC药物使用鼠源性单抗不同，第二代ADC药物使用了以曲妥珠单抗为代表的人源化单抗，针对肿瘤细胞的靶向性得到提高。同时第二代ADC使用了毒性更大的小分子，偶联方式上仍与第一代类似，linker的稳定性仍待提高。代表药物为2011年上市的Seattle Genetics生产的Adcetris和2013年上市的罗氏生产的Kadcyla，Kadcyla也是首个批准用于实体瘤治疗的ADC药物。第三代ADC药物的进化主要得益于定点偶联技术的发展，更精确的偶联技术可控制高活性药物分子在抗体上偶联的位置和数量，具有更高的均质性而提高药物纯度、质控等。保证了DAR稳定可控，降低了药物的毒性。
表1 三代ADC产品对比
抗体是ADC设计的重要组成部分，首先要有靶点特异性，抗体承担着将细胞毒性药物递送至肿瘤细胞的任务；其次是抗体与靶标结合的亲和力，抗体应具有对抗原的高亲和力；此外抗体还应具有低免疫原性，低交叉反应性和良好的与linker的结合能力。在第一代ADC中，针对目标抗原使用的是鼠源抗体。这种鼠源抗体的缺点就是较强的免疫反应，许多患者产生了抗抗体，导致治疗效果不理想。但是，随着基因工程技术的发展，这个问题在第二代ADC中得到解决。在第二代ADC药物中，鼠源抗体转变为小鼠/人源化嵌合抗体。嵌合抗体由小鼠的轻链和重链可变区与人源抗体的恒定区相连组成。人源抗体的恒定区有助于降低免疫原性和减少人们产生抗小鼠抗体，所以显示出了良好的治疗功效。然而，在某些情况下，嵌合抗体的治疗效果降低是由于发现了人抗嵌合抗体中鼠源可变区的抗体。为了解决这个问题，科学家们正在努力设计出一种人源化的单克隆抗体。人源化抗体只含有啮齿动物可变区的互补决定区，再与人源抗体可变区进行嫁接。第三代ADC使用的是完全人源化的抗体，来代替第二代ADC中的嵌合抗体。与第二代ADC相比，这种ADC设计的优点是人源抗体不会产生免疫反应。
将payload和抗体连接起来的linker也是ADC的基本结构组件之一，为了达到降低全身毒性，提高靶向细胞毒性的效果，linker必须在循环系统中保持稳定，但是当ADC药物分布到肿瘤组织并进入肿瘤细胞当中（例如抗体结合肿瘤细胞表面特有的配体时，ADC被内吞入肿瘤细胞中）时，也要允许细胞毒性分子有效释放。稳定性弱的linker容易发生非特异性裂解，从而导致严重的全身毒性。为了避免ADC聚集体的产生，linker也要有高亲水性。linker一般可分为两类：可切割linker与不可切割linker。可切割linker会在payload和抗体附着点之间存在一个可切割位点，该位点可以通过一些机制发生裂解，包括酸不稳定键的水解，酰胺或酯键的酶裂解，或二硫键的还原裂解，这些过程可能发生在核内体、溶酶体或细胞质中。可切割linker的类型如下：
表2 可切割linker的对比
以不可切割linker构建的ADC药物分子，需要抗体部分的完全降解才能以氨基酸-连接子-小分子毒素复合物的形式释放细胞毒性分子。不可切割的linker类型如下：
表3 不可切割linker的对比
两者的区别在于，不可切割linker在血液循环中一般更为稳定，但是最后代谢形成的氨基酸-连接子-小分子毒素复合物没有细胞穿透性，因此仅能对肿瘤抗原高表达的肿瘤细胞起到杀伤作用，而对周围低表达的肿瘤细胞杀伤作用有限，不能发挥bystander效应。对于可切割的linker，它能够在特异地在靶细胞中被切割释放出小分子毒素，从而发挥细胞杀伤作用，同时释放出的小分子毒素能够透过细胞达到附近低表达或者不表达肿瘤抗原的肿瘤细胞，发挥bystander效应。可切割的linker已成为当前ADC研发的热点。在设计更有效和耐受性更好的ADC时，越来越复杂的药物化学方法正在改进连接技术。
ADC药物有效进入靶细胞的效率比较有限。ADC药物从进入循环系统到进入靶细胞有很多步骤，例如从循环系统分布到靶组织、抗体部分与靶细胞膜表面配体结合、内化进入靶细胞、payload的胞内释放、payload有效结合靶点来发挥细胞毒性作用。假设即使这些步骤都有50%左右的效率，ADC药物进入靶细胞发挥杀伤作用的效率也只有大概1.56%，并且实际情况下的效率还要低于这个水平。所以payload的细胞毒性必须足够高，使得其在皮摩尔浓度水平上可以有效的杀死靶细胞。同时，理想的作为payload的小分子毒素本身对癌细胞也要有一定的靶向性，因为体内的正常细胞也有几率通过非特异性的胞饮作用或膜表面配体结合ADC药物的Fc片段来内吞ADC药物，同时ADC药物在循环系统中也有可能会降解从而释放出payload，从而造成对正常细胞的杀伤。综上所述，payload的选择主要需要考虑到有效性和靶向性两点。目前能够中断有丝分裂过程的小分子毒素应用最广，因为它能有效阻止癌细胞分裂，同时对分裂不频繁的正常细胞有较小的影响。常用的payload如下：calicheamicins（卡奇霉素）、auristatins（奥瑞斯他汀类）、maytansinoids（美登素类）等。同时，最新研究也发现了一系列新的合适作为payload的化合物，如Duocarmycins（倍癌霉素类）、PBDs、amanitins（鹅膏毒环肽）、微管蛋白类似物等。
表4小分子毒素的对比
Linker可以通过抗体表面的某些氨基酸残基与抗体部分连接，而取决于不同的化学偶联方法，这一过程会产生一系列不同药物抗体比率（DAR）和链接位点的ADC分子。一般来说，ADC药物的各分子之间DAR差异过大可能导致疗效降低，因此需要严格控制DAR的分布区间。高DAR虽然能增加药效，但是会同时增加ADC分子间形成聚集体的风险，导致药物清除率的上升，并且会使得ADC分子过早地在循环系统中释放payload。高DAR导致的风险可以通过使用亲水性强，足够稳定的连接剂来降低。总的来说，确定每个ADC的最佳DAR值和控制DAR的分布区间是至关重要的，这可以最大程度地平衡疗效、人体耐受性和细胞毒性水平。
1、赖氨酸残基偶联该方法是早期ADC药物中主要的ADC偶联方法。该方法通过含有活性羧酸酯位点的linker来将payload连接在抗体的赖氨酸残基上。但是经典的抗体结构中，一般会有大约80个赖氨酸残基，构象上便于linker连接的也有大约10个，所以通过赖氨酸残基偶联方法得到的ADC分子会有多种不同的DAR和linker结合位点。因此，基于赖氨酸残基的偶联方法的重点是需要努力开发稳定的工艺，确保得到的ADC分子的DAR可以控制在目标区间内。
图3赖氨酸残基偶联
2.改二硫键还原半胱氨酸偶联及该方法是目前使用最多的偶联方式。以IgG1为例，其中有4对链间二硫键可被还原，还原后得到8个半胱氨酸巯基。Linker上的马来酰亚胺等基团能与巯基反应，形成稳定的偶联物。通过二硫键还原的程度可以优化最终产品的DAR值，例如Adcetris 、Blenrep的DAR值约为4，Trodelvy、Enhertu的DAR值接近于8。
图4 二硫键还原半胱氨酸偶联
3.非天然氨基酸偶联该方法通过构建非天然氨基酸表达系统（例如使用携带非天然氨基酸的tRNA等方式），在抗体中引入非天然氨基酸，在非天然氨基酸位点上与linker连接。这种方式可以得到高度均一DAR的ADC分子。
图5非天然氨基酸偶联
4、酶催化偶联该方法是通过酶识别抗体上特定的氨基酸序列，对相应的位点进行修饰来产生可偶联位点。该方法可以介导特异性的抗体-linker结合，得到高度均一DAR的ADC分子。
5、通过转肽酶介导的转肽作用偶联该方法依赖于转肽酶的催化特性。转肽酶A（Sortase A）可以识别LPXTG （X表示任意一种氨基酸）氨基酸序列，将T-G肽键切割，并连接含oligo-G的分子。利用Sortase A的这个特性，可以在oligo-G上连接各种类型的分子，来实现与抗体特定位点的偶联。
图6转肽酶介导的偶联
6、通过MTG酶（microbial transglutaminase）介导的转肽作用偶联该方法使用MTG酶催化的转肽反应，将含有伯胺的linker共价连接在去糖基化抗体的特定谷氨酰胺（Q295）的伯胺上，因为抗体的每条重链有一个结合位点，所以这种方法得到的ADC分子的DAR值固定为2。
图7 MTG酶介导的偶联
7、通过对抗体天冬氨酸残基上N-聚糖改造的方式来偶联IgG抗体上Asn297和该氨基酸残基上连接的N-聚糖结构非常保守，对该N-聚糖进行一系列的生化反应改造后，可以在其上引入一个醛基，从而可以与payload上通过修饰产生的-O-NH2官能团结合。
图8 N-糖基化偶联
（未完待续）
图文编辑 | 彭庶文
文章撰写 | 高超、吴昊、刘啸波、焦瑞、程遥、王盼、魏欣