单细胞测序是在单个细胞水平对细胞的基因表达等信息进行检测。单细胞研究能够从更高分辨率和时空结构上解码生命。从300多年前直观的细胞形态观测、10年前组学研究到近三年的高通量检测，单细胞相关技术正加速基础研究转化应用。2013-2020年，单细胞测序技术多次被Science、Nature等学术期刊评价为年度重点技术，正引领新一轮生物医学领域的技术革命。单细胞技术已从实验室走向商业化，在2016年-2019年完成第一阶段市场教育，即科研应用，于2020年获得空前关注。接下来单细胞将在资本和技术双轮驱动下推动进一步高通量、低成本和应用扩展。单细胞测序这一新兴产业领域充满了机遇与挑战，如何抓住这一波产业浪潮值得我们深入研究探讨。
单细胞测序技术的持续发展依赖一批里程碑式关键技术的发明和发现（图1）。单细胞测序技术可以揭示出每个细胞独特的微妙变化，极大地推进了各项组学领域的研究，使不同细胞类型得以精细区分，使得科学家在单细胞水平进行分子机制研究成为可能，相关领域发表的论文和关注度呈指数级增加（图2）。
图1. 单细胞测序技术发展历程中的里程碑事件
图2. 单细胞研究文献发表数量增长趋势
推动单细胞测序的测序细胞数显著增加的一些关键技术以及相应的测序规模如图3所示：a2. Islam等人发明使用的STRT-seq实现多细胞并行操作；a3. Integrated fluidic circuit (IFC) chips集成流体通路芯片，如Fluidigm的C1系统；b1. 一些代表性的单细胞测序技术以及相应的测序规模。
图3. 推动单细胞测序的测序细胞数显著增加的一些关键技术及相应的测序规模
b、显微操作法，使用显微镜观察下的毛细管吸液管收集单细胞；c、使用流式细胞仪通过荧光标记蛋白标记并分离单个细胞；d、激光捕获显微切割(LCM)，利用计算机辅助的激光切割系统从固体样品中分离细胞；e、利用微流控技术将单细胞分隔在纳米级体积液滴中，例如Drop-Seq就是使用该方法；f 、抗体结合CellSearch系统，通过使用与CTC结合抗体结合的磁珠捕获患者血液样本中的CTC。
图4. 常用的单细胞分离技术分类
对于单细胞基因组测序来说，需要在单细胞裂解后将其中的基因组先扩增至可测序的水平，常用的方法后面会介绍到，包括DOP-PCR、MDA、MALBAC、LIANTI，之后再按常规基因组测序的方式将扩增后的单细胞基因组建库测序即可。需要指出的是，DOP-PCR和MDA对基因组DNA进行指数扩增，MALBAC对基因组DNA进行准线性扩增，LIANTI对基因组DNA进行标准的线性扩增。线性扩增比指数扩增的扩增精确度和定量准确度都要好，原因如下：由于序列的GC含量不同等原因，每个DNA片段的扩增效率并不相同。假设A和B片段的复制率分别为100和70% /轮，当a片段的最终扩增因子为~10,000时，指数扩增结果为8:1，影响了cnv（拷贝数变异）检测的准确性。相比之下，线性放大的比例是1:0.7，这更接近于统一。线性放大在保真度上也优于指数放大，在指数扩增中，一个在第一个周期中复制人类基因组的保真度最高的聚合酶会产生~300个错误，这些错误将在下一个复制周期中永久传播，导致snv假阳性。而在线性放大中，误差会随机地出现在扩增子的不同位置，并且很容易被过滤掉。
2.2.1简并寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR）
图5. DOP-PCR技术示意图
DOP-PCR全称是简并寡核苷酸引物PCR，原理是使用简并核苷酸引物进行全基因组扩增。这种引物的3’端是6bp的简并核苷酸序列，在5’端包含一个固定序列。对于初始扩增，随机引物在低温退火下与DNA模板结合(约30℃)，3’端的简并核苷酸序列可以随机结合在基因组的任何位置上。然后升高温度DNA链延伸，在下一轮扩增时，简并寡核苷酸引物再次随机结合在合成的单链DNA上，延伸合成双链DNA。此阶段可以扩增出大量两端为引物5’端固定序列的DNA分子片段。然后进行第二阶段扩增，基于5’固定序列设计引物，在较高的退火温度下初始扩增的产物。该技术的缺点是扩增后的基因组覆盖度不好，首先因为指数扩增导致的扩增均一性差，其次在初始扩增时，延伸过程中遇到下一个引物结合位点即停止延伸，再加上未延伸完全就因进入下一轮温度循环停止延伸的情况，使得该扩增方法对基因组的覆盖率大打折扣。
2.2.2多重置换扩增技术（MDA）
图6. MDA技术示意图
为了解决DOP-PCR扩增基因组覆盖率低的问题，出现了另一种全基因组扩增方法——多重置换扩增技术（MDA）。使用随机六聚体引物和φ29DNA聚合酶进行结合与扩增。其中引物是由6 个随机核苷酸组成。主要利用的是φ29DNA聚合酶的特性，它是一种高保真聚合酶，具有3'到5'外切酶校读能力，且具有特殊的多重置换和连续合成特性。反应时，引物六聚体先随机结合到DNA 模版上，在φ29 DNA 聚合酶催化下延伸。当遇到另一条新链随机引物时，φ29 DNA聚合酶替换引物，继续延伸形成支链结构，新的引物和聚合酶会在支链上重新结合延伸，所形成的DNA片段一般为50~100kb。因为在延伸过程中遇到下一个引物结合位点不会停止延伸，使得MDA 的扩增覆盖度远高于DOP-PCR。MDA为指数扩增，故仍存在扩增偏倚性的问题。为了克服偏倚性缺陷，在MDA 基础上出现了ddMDA，eMDA，TruePrime 等技术。ddMDA，eMDA 都是在通过把扩增分散到数百万的小液滴中完成，实现提升扩增均一性和纠正偏倚性的目的；TruePrime 则是将MDA 中的随机六聚体引物替换为一个以DNA 为模板的引物合成酶，从而提高扩增均一性。
2.2.3多重退火成环循环扩增技术（MALBAC）
图7. MALBAC技术示意图
为了解决指数扩增导致的扩增偏倚性的问题，谢晓亮老师课题组于2012年发明了新的全基因组扩增方法MALBAC，多重退火成环循环扩增技术。该方法引入了线性扩增的特性，减少了因指数放大而加重的序列相关偏差，最近它也被应用于单细胞转录组测序。MALBAC引物序列5’端由固定的27bp核苷酸序列（红色）构成，3’端由8bp随机核苷酸序列（黄色）构成。退火时引物可以均匀地结合在DNA模板上(15 - 20℃)——升高温度(70–75℃)进行DNA新链合成，此步骤得到不同长度的半扩增子(0.5-1.5 kb)——半扩增子与模板解离(95℃，后面半扩增子上也结合引物扩增形成全扩增子时，此步骤也会使得全扩增子与半扩增子解离)——再次退火（58℃）使引物与半扩增子和初始DNA模板结合（有全扩增子存在时，此步骤会使得全扩增子由于3’端和5’端互补配对成环而不参与下一轮扩增）——升高温度(65℃)在DNA模板上合成新的半扩增子，在半扩增子上合成3’端和5’端互补的全扩增子。这个循环重复8-12次，MALBAC的关键是不复制最终的全扩增子，而只复制作为全扩增子模板的半扩增子，图中m是温度循环的次数(m=0~10)， n是每条DNA链结合引物数，(m +1)×n为m个温度循环周期产生的半扩增子数，m×n2为m个温度循环周期产生的全扩增子数。最终得到的全扩增子可以在第二轮扩增阶段通过PCR扩增。
2.2.4基于转座子嵌入的线性扩增技术（LIANTI）
图8. LIANTI技术示意图
LIANTI全称基于转座子嵌入的线性扩增技术（Linear Amplification via Transposon Insertion），是在谢晓亮老师参与下发明的一种标准的线性扩增技术。该方法利用Tn5 转座酶结合LIANTI 转座子序列形成Tn5 转座酶复合体（LIANTI转座子序列由一个19 bp的双链转座酶结合位点和一个单链T7启动子环组成），然后用Tn5 转座酶复合体去随机插入单细胞基因组DNA，将基因组片段化并将片段化后的双链DNA两端的5’端连接上LIANTI 序列——通过DNA聚合酶补全双链——再通过DNA两端LIANTI 序列中T7启动子来进行体外转录——得到的大量单链RNA3’端LIANTI 序列形成发卡架构后以此为引物进行逆转录——将逆转录产物RNA部分降解，对剩余的单链DNA3’端LIANTI 的部分序列设计引物（为了区分每个细胞来源的DNA，可在此引物5’端增加barcode序列）进行第二条链的合成——对这些双链DNA进行常规建库测序。
2.2.5单细胞基因组扩增试剂盒
目前市面上大部分的单细胞基因组扩增试剂盒是基于DOP-PCR、MDA、MALBAC三种技术，不同的试剂盒使用过程中的一些特点如表中所示。
表1. 单细胞全基因组扩增产品优势分析
2.3 mRNA反转录+cDNA扩增+构建测序文库对于单细胞转录组测序来说，该步骤包含单细胞裂解、RNA反转录、cDNA的扩增、测序文库的制备几个步骤。单细胞裂解不用赘述，但是RNA的反转录和cDNA的扩增则要考虑到每条RNA的扩增效率对最终定量结果的影响。有些方法在反转录步骤中加入了独特的分子标识符UMIs和条形码barcode，可以将每个reads追溯到细胞中原本表达的mRNA，从而有效地消除扩增偏差，提高定量准确性，并且可以允许多细胞样本混合建库测序，降低工作量和测序成本。但是一般经过标记的测序方法一般只能保留转录本3’端部分信息，因此不适用于检测等位基因特异性表达或表达亚型使用，无UMI标记的Smart-seq/Smart-seq2 则可以生成全长转录本。
图9. 多种技术方法示意及对比
cDNA扩增常用的方法有IVT和PCR两种，各有优劣。IVT是cDNA进行体外转录，转录出足够量的RNA之后再对这些RNA进行反转录得到足够量的cDNA。这种方式可以线性扩增模板，但耗时较长，并且因为需要额外的反转录，可能导致3 '覆盖偏差。PCR指数扩增则会放大各条mRNA扩增效率的差异导致的误差。再经过以上步骤得到测序水平的DNA量之后，Illumina的高通量测序平台被广泛应用于测序步骤(如HiSeq4000和NextSeq500)。
2.3.1 CEL-SEQ/CEL-SEQ2
图10. CEL-SEQ技术示意图
一般使用富鲁达的C1系统来分离单细胞——使用5’端加上T7启动子、barcode、UMI序列的polyT来捕获mRNA的polyA尾，并作为引物进行逆转录第一条链的合成——通过随机引物来进行第二条链的合成，形成的双链cDNA的第一条链5’端为T7启动子序列——双链cDNA通过T7启动子体外转录（IVT）得到大量mRNA——将这些RNA再次逆转录，得到的cDNA进行建库测序。Cel-seq2方法在该方法基础之上有所改进，主要在这两点，一是使用的试剂盒不一样，mRNA反转录时第一条链和第二条链合成时都使用Super-Script® II Double-Stranded cDNA Synthesis Kit；二是在两次反转录的第一条链合成步骤中加上illumina测序接头。第一次逆转录可以在引物的T7启动子之后barcode、UMI之前加上illumina测序5’端的接头序列（图中蓝色部分），第二次逆转录在随机引物的5’端加上illumina测序3’端接头序列（图中黄色部分），这样形成的大量cDNA就直接是两端加好illumina测序接头的测序文库，避免illumina测序时为了加测序接头而进行的前几个PCR循环，因为这些循环中接头的连接效率并不高效，并且引入了干扰测序的引物二聚体。
2.3.2 DROP-SEQ、DroNc-seq
图11. DROP-SEQ技术示意图
DROP-SEQ的大致流程：使用微流控系统来分离单细胞，使每个细胞和用于捕获mRNA固体微珠以及细胞裂解液独立的分布在油相包裹的液滴当中，固体微珠表面连接了几十万条寡核苷酸序列，从5’端开始依次是一个通用23bp的模板切换寡核苷酸（template switching oligonucleotide，TSO）PCR引物结合序列、12bp的barcode序列（同一微珠barcode相同，用于区分mRNA的细胞来源，一共可以有412种）、8bp的UMI序列（同一微珠上的寡核苷酸序列UMI不同，用于判断mRNA的初始转录本数量，共有48种）、polyT序列——细胞在裂解液中被裂解，释放出mRNA，被微珠上连接的寡核苷酸序列3’端的polyT捕获——单个细胞的液滴破裂，所有的液滴混合在一起统一进行反转录，第一条cDNA链合成时，利用polyT作为引物，使用MMLV逆转录酶进行第一条链合成，由于MMLV逆转录酶的特性，第一条链合成完成后会在该链3’端添加3个额外的C碱基核苷酸——使用在之前提到的TSO引物结合序列（图上标记为PCR的蓝色一段）3’端增加三个RNA碱基G的寡核苷酸序列作为引物，同样在MMLV逆转录酶的催化下进行第二条链的合成，得到两端有相同TSO引物结合序列（蓝色）的cDNA——对蓝色部分序列，使用TSO作为引物即可对cDNA进行PCR扩增，得到大量的测序水平的cDNA分子数——使用Illumina Nextera XT试剂盒，该试剂盒利用转座酶的活性对可以同时将cDNA进行片段化并加好测序接头，得到的DNA测序文库的平均长度为500-680bp。
与DROP-SEQ类似方法有DroNc-seq：细胞核单细胞转录组测序，适用于无法制成细胞悬液的组织细胞，如神经细胞；和冰冻切片样本，该技术关键在于从样本中提取细胞核，后续步骤其实还是基于DROP-SEQ。由于细胞核中转录行为小于整个细胞中的，所以会相应地调整油、细胞悬液、捕获mRNA的珠子悬液流速，减小形成液滴的体积。
2.3.3 MARS-SEQ
图12. MARS-SEQ技术示意图
MARS-SEQ原理与CEL-SEQ2类似，通过经过设计的带polyT的寡核苷酸序列捕获mRNA并反转录，通过体外转录的方式线性扩增cDNA。但在加illumina端测序接头的方式上，MARS-SEQ方法在5’端加接头方式与CEL-SEQ2相同，直接通过第一次反转录引入，但是关于在3’端加接头的方式，CEL-SEQ2是使用带测序接头的随机引物反转录体外转录得到的RNA来将测序接头引入片段，而MARS-SEQ是先用已知接头序列互补的ssDNA与体外转录的RNA连接，再反转录引入测序接头，同时第一轮加的接头只是部分测序接头，需要通过以这部分测序接头再次设计引物，进行几轮PCR来引入完整的测序接头序列。
2.3.4 Smart-seq/Smart-seq2、SCRB-seq
Smart-seq
Smart-seq2
图13. Smart-seq/Smart-seq2技术示意图
目前市面上已有成熟的基于Smart-seq技术的试剂盒（SMARTer Ultra Low RNA Kit ，Clontech），使用该试剂盒可以将单细胞的mRNA反转录，扩增，并构建illumina测序文库。大致流程与DROP-seq非常类似，不过polyT引物上没有连接barcode和UMI序列，大致的建库过程如下：一般通过C1系统捕获并分离单细胞之后，将细胞裂解释放mRNA，以一段CDS序列（Coding sequence，AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)VN，绿色adaptor部分TSO引物结合序列+ployT）为引物，在MMLV反转录酶的催化下进行反转录第一条条链合成，当然，会在cDNA第一条链3’端添加3个额外的C碱基核苷酸，第二条链合成时就可以使用设计好的引物（5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrGrG-3′，黄色adaptor部分TSO引物结合序列+3个RNA碱基G）来与第一条链3’端3个C互补配对作为引物，使用MMLV反转录酶通过模板替换替换掉RNA模板，并合成cDNA第二条链。这样得到的cDNA包括了mRNA的全长信息，并且在两端加上了通用的PCR引物结合位点。接下来通过通用的PCR引物（TSO）进行扩增（12 cycles for 1 ng of total RNA, 15 cycles for 100 pg of total RNA, and 18 cycles for 10 pg total RNA or from single cells）。对这些cDNA使用“PE”protocol（Illumina’s Ultra Low Input mRNA-Seq Guide）或者“Tn5”protocol（Epicentre公司的Nextera试剂盒技术，已被illumina收购）来进行illumina测序建库。“PE”protocol是经典的illumina高通量测序建库方式，先将cDNA超声打断，通过末端修复，加A之后，连接上PE测序接头；“Tn5”protocol和DROP-seq相同，使用Nextera的试剂盒，通过转座酶酶切的方式对cDNA进行片段化并连接测序接头。
Smart-seq2是Smart-seq的改进版本，与Smart-seq，主要优化了以下几个方面：1、将作为反转录第二条链合成的引物的TSO3’端的rG替换为经修饰的G，提高TSO的热稳定性，以及与第一条链3’端三个C互补的能力；2、优化了反转录、扩增步骤的反应体系。SCRB-seq类似于Smart-seq，但是在polyT引物5’端增加了barcode和UMI序列，基本上完全等同于DROP-seq，只是与DROP-seq的单细胞分选方式不同。
2.3.5 Sci-RNA-seq
图14. Sci-RNA-seq技术示意图
首先将使用甲醇固定并使细胞膜通透的细胞随机放入96或384孔板中，使用5’端增加RTbarcode、UMI序列的polyT序列，在细胞内原位捕获并反转录mRNA，于是在cDNA序列上引入RTbarcode、UMI序列，这是对mRNA的第一轮标记。接下来通过流式细胞仪将第一次分选时每个孔中挑出一个细胞，放入同一个孔中，细胞内再进行第二条链的合成，得到双链cDNA。接下来将细胞裂解，通过Tn5转座酶将双链cDNA酶切片段化，得到B图中UMI+RTbarcode+oligodT+cDNA这部分，因为这部分序列的两端序列是已知的（一端是带有标记的polyT序列，另一端是Tn5转座酶酶切时插入的已知序列接头），那么就可以设计引物来对这段序列进行PCR扩增。这时就可以对每个孔中的细胞进行第二轮标记，因为每个孔的PCR引物也有独特的barcode（i5，i7）和通用的测序接头序列。这样通过反转录时引入的RTbarcode和PCR扩增时引入的barcode（i5，i7），就对每个细胞进行了独特的标记，可以通过测序序列信息区分每个细胞来源的转录本。接下来对扩增出的DNA进行统一的高通量测序，得到的测序结果包含转录本3’端的信息，也可追溯到每个细胞来源。
2.3.6 10X Genomics Chromium
10x Genomics 的仪器发布时间较早，2016 年就推出了具有代表性Chromium 单细胞分析系统和试剂盒。需要提一下的是，BD和10x 平台都采用UMI（Unique Molecular Identifier）+ CL（Cell Label）技术进行单细胞及初始转录本的标记：测序过程中，每个细胞都会和一个微珠一起被单独的隔离起来，微珠之间的barcode（Cell Label）序列都不同，但是在同一颗微珠上的数百万个oligo-dT (dT)引物中的每一个都有相同的细胞标记(CL)序列，这样可以区分转录本的细胞来源；同时，在CL序列旁还有一个独特的分子标识符(UMI)序列，被用于区分被微珠捕获的单个细胞的不同mRNA转录本，可对大规模scRNA-Seq 的基因表达定量，结果几乎不会受PCR 偏好影响而更精确，且可实现更高的细胞通量。
图15. 10X Genomics Chromium技术流程示意图
来自10X Genomics的Chromium系统通过微流控的方式将一个细胞，一个凝胶珠和分子试剂隔离在一个液滴中，流量很可能是通过压力来控制的。在Chromium系统中，凝胶珠的占用率表明50 - 65%的输入细胞应该被捕获在一个液滴中。Chromium凝胶珠上连接的结构包含一个linker、一个固定的TSO引物结合序列、CL+UMI标记系统（16bp的barcode(约73.4万种不同的barcode)、10bp的UMI）和固定的polyT引物。Chromium 系统中cDNA的生成和扩增与Drop-seq非常相似，细胞裂解之后，捕获和反转录mRNA都是通过polyT寡核苷酸序列和MMLV酶的催化，同时引入TSO引物结合序列，使用TSO作为PCR引物进行扩增。但有三处主要不同，一是通过DTT（二硫苏糖醇）还原二硫键，凝胶珠上用于捕获mRNA的的寡核苷酸序列会被释放到液相中；二是先完成逆转录第一链的合成，之后单独的液滴破裂；三是cDNA扩增产物通过酶切方式片段化，再进行加测序接头的步骤，而非通过转座酶将cDNA片段化和加测序接头合并为一步。
图16. 捕获mRNA及反转录过程
图17. cDNA的扩增图示
2.3.7 BD Rhapsody
BD Rhapsody单细胞分析系统是基于的微孔系统的单细胞检测平台，能够同时检测从100-10000个单细胞的基因表达。该技术最初于2015年提出(Fan et al. 2015)，它利用了两个主要的设计:(1)一个由数十万微孔组成的微孔板(2)一个连接不同的barcode的磁珠库。首先，细胞被稀疏地装入微孔阵列中，在重力作用下，每个细胞都进入单孔，根据泊松统计，每个细胞占据一个单孔。再将BD Rhapsody系统的磁珠以饱和水平装入微孔阵列，通过对微孔和磁珠的几何形状和尺寸精心设计，使得每个微孔恰好只能容纳一个磁珠，并且有足够的空间容纳直径≤25 μm的细胞，这样每个细胞都可以与一个磁珠配对。细胞在微孔中裂解，释放的mRNA被磁珠上连接的带有polyT的序列捕获，之后即可通过磁吸的方式将这些磁珠转移到同一单管中，再进行后续的NGS测序建库。BD Rhapsody的磁珠上包含之前提到的CL+UMI标记系统，可通过细胞来源和转录来源来区分每一个被捕获的mRNA。
图18. BD Rhapsody技术流程
BD Rhapsody系统构建测序文库的步骤如下：A、通过BD Rhapsody珠上的寡核苷酸捕获mRNA并逆转录得到双链cDNA分子，将细胞标记(CL)和独特分子标识(UMI)序列连接到cDNA分子上。B、BD Rhapsody磁珠上双链cDNA的扩增和测序，可以使用靶向扩增方法和非靶向扩增方法，靶向扩增方法通过设计3’端引物针对性的扩增某些感兴趣基因；非靶向扩增可以对所有转录本进行扩增以进行建库分析，这时可以通过特殊的酶和引物设计等方式（如10X Chromium使用的MMLV酶加TSO引物），在cDNA的两端加上TSO引物结合位点，然后使用通用的TSO引物进行非靶向扩增。
图19. BD Rhapsody系统构建测序文库
与10x Genomics Chromium相比，BD Rhapsody有以下几点不同：1.不使用微流控技术；4、BD Rhapsody磁珠可以保留，供后期实验使用（结合cDNA的磁珠可以保存好几个月）；5、相比10x Genomics，BD Rhapsody的捕获效率更高，因此可适当降低对起始样品的活性要求。
2.3.8各单细胞转录组测序方法优劣比较
2020年发表在 Nature Biotechnology上的一篇文章《Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods》系统地比较了7种单细胞转录组测序方法在通量、敏感性、区分细胞类型能力、成本、耗时等方面的区别，包括smart-seq2、cel-seq2、10X Genomics Chromium、Drop-seq、Seq-Well、inDrops、sci-RNA-seq等，总结如下（具体评价标准和实验方法可参考原文）：
表2. 各单细胞转录组测序方法优劣比较
表3. 各单细胞转录组测序方法成本与耗时比较
图文编辑 | 彭庶文
文章撰写 | 高超、吴昊、刘啸波、焦瑞、程遥、王盼、魏欣