茶树国家重点实验室发表circRNA最新研究成果
近日，茶树生物学与资源利用国家重点实验室发表了茶树叶芽到嫩叶发育过程中circRNA的结构和分化的最新研究论文。我们非常荣幸地邀请到了本文第一作者童伟博士来为大家介绍本项研究工作。
本文通讯作者韦朝领教授领衔的茶树逆境生理与功能基因组研究团队长期专注非编码RNA在茶树抗病虫及生长发育中的作用（详情请戳：茶树国家重点实验室发表miRNA最新研究成果）。
和普通RNA（线性RNA）相比，环状RNA (circular RNA, circRNA)不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴，呈封闭环状结构，这一结构使它不易被核酸外切酶RNase R降解，故而比线性RNA更加稳定，一般来说circRNA具有高度的保守性。目前认为，circRNA是由前体RNA（pre-mRNA）通过反向剪接反应（back-splicing）这一特殊的选择性剪接产生的。circRNA多数源于外显子（exon），少部分由内含子（intron）直接环化形成。
2012年，Salzman通过RNA-Seq方法首次报道了~80个circRNA[1]。至此借助于高通量测序技术，环状RNA验明正身进入科研视界，大量的circRNA分子被相继发现。植物中，
拟南芥[2, 3]，水稻[3, 4]，玉米[5]，大豆[6]，番茄[7]等的circRNA鉴定分析也已经成功开展，并揭示了部分circRNA的特点和功能。
茶是最为古老和全球最受欢迎的无酒精类饮料, 它不仅对中国人的文化、健康、医药、贸易等产生了深远的影响, 而且在亚洲乃至整个世界众多人民的日常生活中也发挥着重要作用, 茶树已成为许多地区有重要价值的栽培植物。茶树基因组[8, 9]的公布为茶树的分子生物学，遗传学以及基因组学等的发展提供了十分重要的基础。本文报道了茶树中circRNA的鉴定以及在芽和嫩叶中的差异表达模式分析，希望可以为circRNA在大型基因组植物研究提供一些支撑，为茶树中发育以及抗性功能研究提供基础[10]。
研究材料：茶树国家级良种舒茶早，芽和嫩叶
测序方法：rRNA-depleted circRNA-seq，芽和叶中分别产生248.32 and 310.95 million clean reads，与基因组比对后产生152.02 and 187.05 million unmapped reads 进行circRNA鉴定分析。
(1) 茶树中circRNA的鉴定
根据不同circRNA鉴定工具的评估，选择了两个表现比较好软件，CIRCexplorer[11] 和CIRI2[12]，分别进行茶树中ircRNA鉴定，主要结果如下图：
在茶树中总共鉴定除了3174个circRNA，其中55%来源于外显子环化。比较芽和嫩芽中的circRNA发现，753个circRNA在芽和叶中是共有的，而大部分circRNA是两者特有的，表面circRNA在不同组织中有特异性差异。同时，比较两个常用circRNA鉴定软件的结果发现，只有少量的circRNA（342）同时被两个软件鉴定出来，说明不同的鉴定方法和软件对circRNA的鉴定是有比较大的差异的。
(2) circRNA的PCR鉴定分析
通过设计divergent和convergent引物对鉴定出的circRNA进行PCR验证，在随机选择的24个circRNA中，20个circRNA可以被验证，说明茶树中的这些circRNA大部分应该是正确存在的。
(3) 茶树芽和叶中circRNA的差异表达模式分析
经比较分析发现，茶树中的circRNA的表达与其对应的mRNA的表达呈正相关，这与之前在拟南芥和水稻中的的研究是一致的[3]。同时，和芽相比，叶中分别发现了310个上调表达的circRNA和294个下调表达的circRNA。
(4) circRNA与其parental mRNA的定量分析
通过设计divergent和convergent引物对环状（circRNA）和线性（mRNA）的表达进行了定量PCR（qRT-PCR）实验。选择了5个circRNA进行定量分析，结果表明，qRT-PCR的结果与TPM表达量的结果总体上是一致的，同时发现，供试几个circRNA的表达量要比线性RNA的表达量低很多。在circRNA和其parental mRNA的比较上，两者的表达模式不尽相同，部分呈现正相关，部分也呈负相关，但是从TPM的表达量上看两者又呈正相关模式。这些数据表明，circRNA与其parental-mRNA的关系可能比较复杂，仍有待进一步验证。
(5) circRNA与microRNA的互作关系
把鉴定的circRNA和miRbase中34个植物的miRNA数据库进行搜索比对分析，总共发现551个circRNA有至少一个预测的miRNA位点。一些常见的miRNA如miR156, miR159, miR172, miR160, miR164, miR398 and miR482等都被预测出来。79个在叶和芽中差异表达的circRNA和107个miRNA有互作调控关系，其中几个在茶树中报道的miRNAs (Csmi159-1, Cs-miR160-1, Cs-miR164a, Cs-miR166a-1)都有5个以上的circRNA与之互作相关，并且这些miRNA都与植物的生长发育相关。这些结果说明，circRNA可能是和miRNA一样，在植物的ceRNA（competing endogenous RNA）网络中可能有比较重要的作用。
上述研究中的测序及部分数据分析由联川生物提供技术支持
1. Salzman, J., et al., Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One, 2012. 7(2): p. e30733.
2. Wang, P.L., et al., Circular RNA is expressed across the Eukaryotic tree of life. Plos One, 2014. 9(3).
3. Ye, C.Y., et al., Widespread noncoding circular RNAs in plants. New Phytol, 2015. 208(1): p. 88-95.
4. Lu, T., et al., Transcriptome-wide investigation of circular RNAs in rice. RNA, 2015. 21(12): p. 2076-87.
5. Chen, L., et al., Circular RNAs mediated by transposons are associated with transcriptomic and phenotypic variation in maize. New Phytol, 2018. 217(3): p. 1292-1306.
6. Zhao, W., et al., Genome-wide identification and characterization of circular RNAs by high throughput sequencing in soybean. Scientific Reports, 2017. 7.
7. Zuo, J., et al., Deciphering the roles of circRNAs on chilling injury in tomato. Biochem Biophys Res Commun, 2016. 479(2): p. 132-138.
8. Wei, C., et al., Draft genome sequence of Camellia sinensis var. sinensis provides insights into the evolution of the tea genome and tea quality. Proc Natl Acad Sci U.S.A, 2018.
9. Xia, E.H., et al., The tea tree genome provides insights into tea flavor and independent evolution of caffeine biosynthesis. Mol Plant, 2017.
10. Tong, W., et al., Circular RNA architecture and differentiation during leaf bud to young leaf development in tea (Camellia sinensis). Planta, 2018.
11. Zhang, X.O., et al., Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell, 2014. 159(1): p. 134-47.
12. Gao, Y., J. Zhang, and F. Zhao, Circular RNA identification based on multiple seed matching. Brief Bioinform, 2017.
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