血液TMB可用于免疫治疗疗效评判指标 | TMB专题

论文标题：Blood-based tumor mutational burden as a predictor of clinical benefit in non-small-cell lung cancer patients treated with atezolizumab

刊登日期：2018年8月

发表杂志：Nature Medicine

影响因子：32.62

论文单位：加州大学戴维斯分校、基因泰克、Foundation Medicine等机构

1. 摘要

目前，来自加州大学戴维斯分校、基因泰克、Foundation Medicine等机构首次在Nature Medicine上发表关于血液来源的肿瘤突变负荷（bTMB）的文章，来验证其对免疫治疗药物疗效的评价。

由于bTMB 不需要组织样本，只需要血浆样本即可对病人免疫治疗的效果进行评价，所以具有划时代意义。在进行突变基因筛查、免疫组化反应后，许多病人无法提供足够量的样本供医生进行TMB检测，这时候bTMB 的横空出世意味着研究人员找到了与PD-L1表达不相关的一个全新的验证手段。

本文作者分别找到了PD-L1抑制剂atezolizumab和Tecentriq治疗非小细胞肺癌的临床研究，代号分别为POPLAR（NCT01903993）和OAK（NCT02008227）。这两个临床研究收集了足够的患者血液样本本用于回顾研究。结果表明bTMB水平较高的病人（bTMB>16）或PD-L1高表达的病人都能够从PD-1或PD-L1抑制剂治疗中受益。所以对于NSCLC一线治疗来说，在使用PD-L1抑制剂治疗之前必须先对病人进行PD-L1的免疫组化检查。然而实际在临床上医生通常是无法获取足够量的病人组织，这就意味着bTMB 有着传统TMB检测上无法比拟的优势。两项大型回顾性队列首次证实血浆中bTMB可准确重复测量，并且与免疫检查点抑制剂疗效相关。证实了血浆TMB对免疫治疗药物疗效预测的有效性。

2. 前言——肿瘤负荷突变知多少？

在进入正文之前，我们先来了解下肿瘤突变负荷TMB的一些基础知识。随着2018年诺贝尔奖生理及医学奖的水落石出，免疫治疗再次进入了人们的视野之中。

免疫检查点抑制剂的出现开辟了肿瘤治疗的新时代，随着免疫治疗被越来越多的患者所了解，临床上很多肿瘤病人一来医院就诊就要求免疫治疗。然而，免疫治疗并不是适合每一个人。如何进一步实现精准免疫治疗，选择优势获益人群，提高药物经济学效能等等，这是重要且热点的话题。就预测癌症免疫治疗的疗效而言，肿瘤突变负荷(TMB)是一个具有良好前景的全新生物标志物。既往研究证实TMB高与免疫治疗疗效呈正相关。

a. TMB是何方神圣呢？

肿瘤突变负荷(Tumor Mutation Burden，TMB)被人们定义为一份肿瘤样本中，所评估基因的外显子编码区每兆碱基中发生置换和插入/缺失突变的总数。

b. TMB如何真正起作用？

我们知道，体细胞的突变可转录/表达成RNA/蛋白水平，产生新的抗原、蛋白片段或多肽段等，这些新的蛋白被自身免疫系统识别为非自身抗原，激活T细胞，引起免疫反应。因此，当每兆碱基中累积的基因变异数目增多时，就可以产生很多新的抗原，就越容易被免疫细胞识别。

c. TMB与免疫治疗的关系

TMB-H(肿瘤突变负荷高)患者产生的新抗原多，肿瘤会被大量肿瘤特异性T细胞攻击，抗PD-1治疗可以使肿瘤T细胞反应得以更充分的发挥，因此TMB-H的肿瘤对抗PD-1治疗更敏感。

PD-1抑制剂治疗敏感患者TMB高于不敏感患者

PD-1抑制剂治疗TMB-H的患者PFS高于TMB-L患者

d. TMB与PD-L1表达量的关系

美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心在对240例接受PD-1抑制剂治疗的晚期肺癌患者的相关资料进行总结和分析时，再一次发现PD-L1表达高低和TMB高低无关。也就是说，PD-L1表达量低的，TMB不一定低；TMB低的，没准PD-L1表达是高的。当然，那些PD-L1表达量和TMB同时都高的患者，疗效最好，临床获益率为50%；而两者都低的患者，或许实在是不太适合PD-1抑制剂治疗，临床获益率只有18.2%，也就说超过80%的这类患者白白花了钱，还承受了副作用。

e. TMB与MSI的关系

MSI已被批准作为肿瘤免疫检查点抑制剂治疗的分子诊断标志物。即具有MSI-H特征的肿瘤患者，或者错配修复基因缺陷(dMMR)的肿瘤患者，易从PD-1/PD-L1治疗中获益。而Zachary Chalmers等在对6万多肿瘤样本的分析中发现MSI-H患者普通具有高肿瘤突变负荷(83%)，从另一方面也反映出TMB与免疫检查点抑制剂治疗获益是相关的。

f. TMB如何检测？

TMB是潜在的预测PD-1/PD-L1疗效的bio-marker，NGS方法可以用于TMB的检测。 2017年11月FDA批准Foundation Medicine 旗下的FoundationOne CDx(F1CDx)大panel，用于泛癌症临床伴随诊断，其中还包括微卫星不稳定性(MSI)和肿瘤突变负荷(TMB)这两个重要的基因组特征，这预示着利用NGS方法检测肿瘤组织TMB被认可。

另外联川生物根据自主液相捕获专利技术VariantBaits™开发的TMB panel包括579个基因，涵盖了靶向治疗相关的基因变异、免疫治疗相关基因组变化、MSI、新抗原（Neoantigen）预测等。

3. 组织样本tTMB和血液样本bTMB一致性检验

3.1 bTMB流程简介

上图简单描述了bTMB流程示意图，简单来说，先用EDTA采血管（不能使用肝素）搜集全血后在1h内分离出血浆（不能有溶血现象发生），然后对血浆中游离的DNA（cfDNA）进行提取。下一步获得ctDNA测序数据，计算所有等位基因频率≥0.5%的SNV，排除驱动突变和可识别的SNP等，使用公式和算法获得bTMB。POLAR样本作为数据训练集，OAK样本作为数据验证集。

3.2 一致性检验和原因排查

作者在本文所使用的Panel为FDA已批准的FoundationOne (F1) CDx，一共可捕获总计1.1Mb的coding sequence。接下来作者对比了从POPLAR和OAK研究中的组织样本与患者治疗前收集到的血样本得到的bTMB结果，阳性一致率为64%，阴性一致率为88%。总体而言，bTMB和tTMB 评分呈现正相关。

导致bTMB和tTMB差异的原因可能包括：

1） 技术差别，tTMB同时计算等位基因频率≥ 0.5%的单核苷酸变异（SNV）和插入和缺失（等位基因）变化，而b TMB只计算等位基因频率≥ 0.5%的单核苷酸变异（SNV）；

2） NSCLC的瘤内异质性，单个活检样本的突变表达可能和释放入血液的ctDNA表达有显著差异；

3） 样本特征上可能存在差异，例如DNA来源（例如福尔马林固定石蜡包埋的组织来源的DNA与ctDNA）、收集时间、样本类型（活检与切除）、诊断阶段、组织纯度、ctDNA最大体细胞等位基因频率。（MSAF）和cfDNA输入质量，都可能导致TMB结果的差异。

3.3 同一样本不同检测平台的一致性结果

为了确定bTMB和tTMB结果的差异是否源于技术平台的差异，我们选择非试验的ctDNA样本分别用bTMB和tTMB的检测平台，观察两者差异。结果看到两者间的一致性达0.93（Spearman correlation）。

3.4 临床样本和细胞系bTMB和FACT检测对比

为了证实bTMB平台的有效性，研究还选择了临床样本和细胞系，使用bTMB和FACT（FoundationMedicine已经做过验证的一款血检NGS平台），结果发现阳性预测值为93.4%，阴性预测值为93.5%。

进一步对比两个平台的一致性，又对等位基因突变频率（VAFs）进行检测，结果发现两者一致性很高R² = 0.998，但对于等位基因低频突变<1%的检测一致性较低（R²=0.6783）。

3.5 组织样本tTMB和血样本bTMB一致性

肿瘤的异质性是否会影响血液和组织TMB的检测结果呢？血液和组织中TMB计数高（＞30突变）的患者中，有1/3仅在血液样本中检测到的变化，1/4的仅在组织样本中检测到的变化，其余的变化在两者中都被检测出。

4. tTMB对免疫治疗疗效有预测作用

作者尝试了多个cut-off值，无论10、16还是20，都可以看到PFS和OS的获益。在bTMB≥16的人群中，PFS HR为0.57（95%CI 0.33-0.99），实验组与对照组中位PFS分别为4.2个月和2.9个月，中位OS分别为13.0个月和7.4个月。由于bTMB≥16组观察到了更优的PFS获益，最终选择了16为cut-off值。

4.1 该平台tTMB的最佳cut off值

同样基于POPLAR研究队列结果，在OAK人群分析中，cut off=16计算bTMB，患者可以显著从Atezolizumab的治疗中获益。

4.2 验证数据集OAK

在bTMB≥16人群中，作者观察到了PFS和OS的显著获益，PFS HR为0.65（95%CI 0.47-0.92），OS HR为0.64（95%CI 0.44-0.92），进一步确定了16是bTMB预测Atezolizumab疗效合适的cut-off值。

4.3 bTMB和PD-L1标志物的关联

如上图所示，bTMB和PD-L1的表达不相关，均属于独立预测因子。

4.3 两个标志物与疗效的关联

研究还观察到bTMB≥16且PD-L1表达＞50%的患者从Atezolizumab的治疗中获益最多。

5. 展望与不足

这项研究显然还不能直接用于临床，而且这个bTMB 还不能检测indel等指标。目前有多种指标可让临床医生来判断病人究竟是否适合免疫治疗，如PD-L1的表达、dMMR、MSI以及本文提到的TMB。但是论效果还没有达到小分子靶向药的那种效果，如肺癌患者一旦出现T790M即可启动阿斯利康的塔格瑞斯治疗。

作者虽然观察到了bTMB≥16的患者能从Atezolizumab治疗中获益更大，但bTMB＜16的患者也可以从免疫治疗中获益，即使近期PFS与化疗无差异，远期OS却能够显著优于化疗。可见bTMB的检测对于临床决策不具指导价值，无论患者的bTMB是高是低，二线之后都能从免疫治疗中获益。

*本文部分内容转载自王一树、马锐和辛田*

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