蛋白的自我调节机制

文章信息

标题：蛋白自我调节机制——翻译终止通读

日期：2018年1月

杂志：JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY

IF：4.011

机构：University College Cork, University of Utah, Massachusetts Institute of Technology

根据一项研究，人维他命D受体(VDR)通过翻译终止通读在C端添加额外氨基酸产生VDR变体(VDRx)。VDRx能以反馈抑制的方式调节VDR功能。相关研究结果于2018年1月30日发表在JBC期刊上，论文标题为“Stop codon readthrough generates a C-terminally extended variant of the human vitamin D receptor with reduced calcitriol response”。论文通讯作者为爱尔兰国立科克大学及美国犹他大学的John F. Atkins教授。论文第一作者为爱尔兰国立科克大学的Gary Loughran博士。

VDR属于核受体超家族的配体-诱导转录因子，主要与骨化三醇通过其C末端结构域结合，进而在细胞内发挥作用。翻译终止通读导致VDR在C端的67个氨基酸延伸产生变体VDRx。VDRx可以与VDR形成同/异源二聚体调节VDR在细胞内的浓度，但是VDRx即使在维甲酸X受体存在的情况下，也没有表现出明显的转录调控活性。

VDR的翻译终止通读

过去翻译终止通读仅被认为存在于病毒，以丰富他们的蛋白种类。近年来，越来越多的翻译终止通读案例被发现存在于真核生物。特别是在脊椎动物中，保守序列UGA_CUAG与翻译终止通读高度相关。经全基因组测序发现人体中含有这个特征序列的基因共23个，其中OPRL1, OPRK1, AQP4和MAPK10这4个基因早在2014年就已经被证实存在通读现象。在该项研究中，剩余19个基因的翻译通读效率均采用双荧光素酶报告基因实验测得(1.3~6.7%)，其中VDR基因表现出最高的通读效率。

图1 OPRL1, OPRK1, AQP4和MAPK10的翻译终止通读

图2 19个基因的翻译终止通读效率

在蛋白水平上，HA-VDR-TGA(正常组)，HA-VDR-TAA(阴性对照)和HA-VDR-TGG(阳性对照)三种融合蛋白分别通过与anti-HA，anti-VDR和anti-VDRx抗体进行免疫共沉淀实验来检测VDR的翻译终止通读产物。

图3 通过免疫共沉淀检测VDRx

 

通读产物VDRx细胞内功能

EEF2和DNMT3B能与VDR相互作用，EEF2是主要位于细胞质中的真核延伸因子2，DNMT 3B是DNA甲基转移酶的β3主要位于细胞核中。为验证VDRx功能，研究人员利用Western Blot观察HA-VDR-TGA与HA-VDR-TGG融合蛋白在细胞中的位置，发现VDR与VDRx在细胞中的定位一致，说明了VDRx与VDR相互作用的可能性。为了进一步证实VDRx能通过形成同源或异源二聚体调控VDR细胞内功能，作者将HA标记的VDRx, VDR, RXRa和eRF1分别与GFP荧光标记的VDRx和VDR共转染HEK293T肾细胞。Western Blot显示有且仅有VDR与VDRx共转染的细胞系能被anti-HA抗体所检测。这一结果有力的证明了VDR通读产物调节原蛋白功能这一猜想。

图4 Western Blot验证VDRx细胞中位置与结合蛋白

鉴于VDRx在细胞中定位与VDR一致，因此不能排除VDRx兼备调节基因表达的功能。例如，AMD1的通读产物与AMD1都能促进S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)的脱羧化作用。通过加入VDR配体发现，1nM的骨化三醇足以明显增加VDR的表达量。而对VDRx而言，100倍骨化三醇的才能得到类似的表达量增长率。因此VDRx不直接参与基因的转录调控，更可能作为一种辅助因子调控VDR的活性，从而间接的影响基因表达。对50多个物种的VDR进行验证，发现其在翻译水平均存在通读现象，说明这一表达调控机制在进化上高度保守。

图5 VDR与VDRx在骨化三醇作用下的表达量

图6 多物种的VDR通读现象反映的进化学意义

 

参考文献

1. Loughran G , Jungreis I , Tzani I , et al. Stop codon readthrough generates a C-terminally extended variant of the human vitamin D receptor with reduced calcitriol response[J]. Journal of Biological Chemistry, 2018:jbc.M117.818526.

2. Yordanova, M. M. , Loughran, G. , Zhdanov, A. V. , Mariotti, M. , Kiniry, S. J. , & O'Connor, P. , et al. (2018). Amd1 mrna employs ribosome stalling as a mechanism for molecular memory formation. Nature, 553(7688).

3. Loughran G , Chou M , Ivanov I P , et al. Evidence of efficient stop codon readthrough in four mammalian genes[J]. Nucleic Acids Research, 2014, 42(14):8928-38.

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