Plant cell：单细胞转录组在根细胞发育和逆境响应中的动态变化 | 单细胞转录组专题

文章题目：Dynamics of Gene Expression in Single Root Cells of A. thaliana

发表期刊：Plant cell

发表时间：2019.3

影响因子：8.228

发表单位：华盛顿大学

摘要

单细胞RNA-seq可以提供高分辨率、细胞类型特异性的基因表达信息，揭示新细胞类型和细胞谱系的发育轨迹。作者捕获了3121个拟南芥根（全根）细胞进行单细胞转录组测序。利用Monocle 3对所获得的单细胞转录组进行无监督聚类，拟时序分析构建了单细胞发育轨迹，鉴定了数百个具有细胞类型特异性表达的基因，同时对几个细胞谱系的拟时分析揭示了沿着发育轨迹表达的已知基因和新基因。作者还鉴定了不同发育阶段富集的转录因子motif，以及参与驱动基因表达模式的建成、与这些motif对应的转录因子。作者评估并解释了随着发育轨迹变化，细胞整体RNA表达的变化，并显示发育轨迹的分支点标志着细胞的发育决策。最后通过对幼苗进行热胁迫处理，作者解答了植物响应非生物胁迫时不同细胞类型是否存在异质性这一长期存在的疑问。尽管响应高温的热激基因在不同细胞类型中存在优势表达，但仍有一些其它的基因在不同细胞类型中存在显著差异。

文章结果

一、全根单细胞测序揭示皮层、内胚层、根毛、非根毛、中柱细胞群体

取拟南芥全根制备成原生质体后，利用10X Genomics平台，捕获到3121个细胞（测序数据量79483000个reads，平均基因组比对率73.5%，转录本表达中位数6152，每个细胞平均检测到的基因数是2445）。

作者选择了表达变化最大的1500个基因进行主成分分析，在获得的100个主成分中，选择前25个主成分（72.5%解释度），采用UMAP（uniform manifold approximation and projection）方法进行了细胞聚类，共获得11个聚类（下图A）。其中第9和第11类群细胞平均mRNA表达量高于其他细胞类群，为了排除这两个细胞群体的细胞主要是多细胞（捕获生成的GEM包含多个细胞），作者利用Scrublet进行了分析，排除了多细胞的可能性（3021个细胞中只有6个为多细胞）。

作者选择两个组织特异性表达谱数据（芯片）和一个细胞特异性的表达谱数据（RNA-seq），芯片和测序数据分别与每个单细胞表达谱数据进行相关性分析（Spearman、Pearson），并对芯片数据中提取的530个细胞特异性marker基因在细胞中的表达进行了聚类（下图C），对11个细胞类群进行了定义：根毛细胞、非根毛细胞(含早期和晚期聚类)、皮层细胞、内胚层细胞和中柱细胞(含木质部和韧皮部细胞)（下图A、B）。

作者分析了单细胞转录组和bulk转录组数据的契合程度，发现二者相关度很高（R²=0.52，p=0.71）（下图D）。进一步将单细胞转录组和拟南芥根三个不同区段（分生区、伸长区、成熟区）的bulk转录组数据进行了比较，发现单细胞转录组数据与伸长区（R²=0.7，p=0.83）相关性最高、成熟区（R²=0.58，p=0.70）次之（下图E）。由于整根中成熟区细胞最多，以上数据表明年轻细胞在制备原生质体时更容易被消化，对数据贡献度更高。由于分生组织在根中占比最小，所以分生组织区的相关性最低（R²=0.11，p=0.43）。

通过比较单细胞测序鉴定的细胞数和与其他数据集关联预测得到的细胞数量，在单细胞测序中发现了期望的皮质细胞、内皮细胞、非根毛细胞和小柱细胞数量，而根毛细胞数量比预期细胞数多，中柱细胞比预期细胞数少，表明在全根原生质体制备时存在细胞偏好性。

二、单细胞测序揭示细胞、组织特异性基因表达

构建并定义11个细胞聚类后，已知组织marker基因在11个细胞群体中表现出特异性、高表达（下图A）。随后采用Monocle3的Moran’s I test，鉴定了317个细胞聚类特异表达基因，其中164个属于新发现的基因（下图A）。

为了验证转录因子推动了细胞类群的特异表达模式，作者分析了细胞群体特异基因近端调控区域（TSS上游500bp）转录因子motif的富集程度，发现了显著的细胞类群转录因子motif富集（下图B）。转录因子属于大的基因家族，直接用于判断哪些特定转录因子参与细胞聚类特异性表达比较困难，所以作者分析了每个细胞群体特异motif对应的转录因子的表达情况，发现对应的转录因子也具有细胞群体特异表达（下图B）。

三、中柱细胞类群中鉴定新的、细胞类群特异表达基因

作者选择中柱细胞进行了亚群体分析，共获得了6个亚聚类（下图A、B），5个亚聚类细胞数超过40，包括：木质部极中柱鞘细胞（205）、韧皮部柱中柱鞘细胞（84），韧皮部细胞和木质部细胞（77、72），韧皮部伴生细胞。对不同亚群体特异基因表达模式进行分析，发现几乎每个细胞亚群体特异性表达了已知的新鉴定的marker基因（除了APL基因）（下图C、D）。

四、拟时序分析皮层、内皮和根毛细胞发育进程

通过分析单细胞数据与bulk转录组数据的斯皮尔曼相关性系数，作者将所有细胞状态划分为13个发育阶段（下图A），其中根毛细胞被指定为根发育的起始点，与根发育起始的距离可以定义其他根毛细胞的发育状态（下图B），涉及到区分早期根毛和晚期根毛的相关基因包括AT5G04120、AT5G04580(下图C)。

根毛细胞在逐渐成熟时会经历核内复制，基因组拷贝数变为16N，尽管核内复制被认为会增加转录效率，但是作者发现在此过程中一般转录本降低但根毛特异基因表达升高，在细胞发育过程中细胞中mRNA总量逐渐降低（下图D），根毛细胞特异性基因表达升高（下图F），对996个基因的RNA 速率（RNA velocity）分析也发现，在分化过程中RNA 速率增高，特别是在4N和8N阶段。通过转录因子motif分析，鉴定到了在发育早期和晚期富集的motif，同时确定了发育早期到晚期富集motif对应转录因子的表达趋势（下图F、G）。

Monocle 3没有分析出皮层细胞的发育轨迹，所以作者重新做了UMAP非线性降维分析以及聚类，并将皮层细胞基因表达与bulk表达谱数据进行相关性分析（与COR皮层marker基因高相关（下图B），构架了皮层细胞的发育拟时序分析（下图A-D）。通过转录因子motif分析，鉴定到了在发育早期和晚期富集的motif，同时确定了发育早期到晚期富集motif对应转录因子的表达趋势（下图F、G）。

五、发育轨迹的分支点标志着细胞的发育决策

发育轨迹图反应细胞从早期到晚期发育的差异，同一种细胞类群一般不会出现发育轨迹分支，但是在第8个细胞聚类中（包含早期非根毛细胞和一些侧根帽细胞），作者发现了发育分支。通过principal graph test作者分析了此细胞聚类和其他细胞聚类的差异（下图A），显著性富集基因功能涉及细胞板的形成，细胞分裂和细胞周期（特别是G2基因）（下图B）。AUR1和AUR2基因参与侧根形成和细胞板形成，在第8个细胞聚类中特异性表达（下图C）。

六、热处理的根细胞在细胞类型间表现出细微的表达差异

在研究植物对非生物胁迫(如高温或干旱)的反应时，一个主要问题是相关反应在不同细胞类型间出现不均匀的程度。一般来讲，热处理时会出现少数基因（热激基因）的快速上调和其他基因的快速下调。作者研究了发育中的根中是否所有细胞都能表现出典型的热应激响应，38℃处理45min萌发8天的幼苗后，和对照组样本做单细胞测序，处理和对照分别捕获了1009（4079个基因/cell）和1076个细胞（4384个基因/cell），并采用mutual nearest neighbor方法将细胞嵌入到UMAP图谱（下图A）。分析在热处理条件下根毛细胞群体基因表达，发现绝大部分根毛特异基因下调而热激基因上调（下图B-D），且作者筛选得到了2627个显著性差异基因（|log2FC|>1&FDR < 0.1%)）(下图 E)。由于这些根毛、非根毛和皮层细胞是根的三个最外层细胞层，更直接地暴露在热冲击下，反应更快，所以它们的特异基因中很大比例表达差异；根毛细胞（细胞类群2）差异表达基因主要是核糖体和RNA甲基化相关基因；中柱细胞（细胞类群6）差异基因涉及到细胞壁发生；内皮细胞（细胞类群4）差异基因主要涉及到化学和应激刺激、硝酸盐和阴离子的转运。

热激蛋白的表达可保护细胞免受热休克，并有助于其恢复。作者感兴趣的是是否能够检测到典型热应激反应中的细胞类群和细胞类型特异性差异。原则上可以利用这种差异，以细胞类型特异性方式改变热休克蛋白表达，以提高植物热和耐旱性，而不会降低整体生物适应性。作者分析了热应激时差异表达的1783个基因，和位于热激时可接近性调节区域附近的1730个基因在单细胞数据中的表达变化。在单细胞表达分析中， 1783个热响应基因中有752个在热应激时差异表达，动态调节区域附近的1730个基因中有564个差异表达。总体而言，细胞反应由典型的热应激基因支配，在热应激时显示极端可及性和高表达的63个基因主要包含在两个细胞类群中（下图A，细胞类群4，49/63;下图C，细胞类群2，42/63）。

文章还揭示了一些组织类型之间细微但显著差异的基因（下图A，B，细胞类群3和8，下图C，D，细胞类群5和7），虽然这些基因中大多数没有富集到特定的功能，但细胞类群8基因与rRNA代谢过程相关，细胞类群5的基因富集了转运基因。

在这项研究中，作者依靠大量和详细的拟南芥不同细胞和组织类型的bulk表达谱数据来确定单细胞测序方法的有效性。通过此文，发现作者采用的方法（单细胞转录组测序）与来自传统分子遗传学数据具有极高的相关性，表明即使是一些了解较少的拟南芥组织或其他植物，包括作物，可以采用这些方法开展研究。 因此，单细胞转录组测序持续发展将对植物在发育和环境响应的研究中产生重大影响。

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