小哥哥实验笔记之——磁珠法全血样本的DNA提取学习 | 学习专栏

我们实验室有一群非常睿智的小哥哥，WK就是其中一枚，WK不仅做事认真负责井井有条，而且特别善于思考，热爱学习拓展，就像本次关于磁珠法全血样本的DNA提取，WK自己开动脑筋，积极主动的增加了样本属性的学习，试剂方法的学习，以及对实验过程的细节进行了总结，还自己动手画了流程图等，接下来我们就跟着小哥哥来一起学习磁珠法全血样本的DNA提取吧，包教包会哦~

一. 样本学习

1. 血液的组成包括血浆、白细胞、血小板、红细胞等。

2. 由于红细胞和白细胞膜结构不同，红细胞存在渗透脆性，在低渗溶液中易发生溶血；

3. 常见采血管主要有EDTA抗凝管（紫帽-图1所示）及肝素抗凝管（绿帽-图2所示）。因为肝素是一种含多量硫酸基团的粘多糖硫酸酯，在核酸提取步骤中很难去除，后续实验中会抑制PCR反应中DNA聚合酶的活性；同时肝素能结合并激活全血中多种蛋白酶原和补体系统，由此引起的一系列酶学效应使 DNA 在提取过程中不断降解；因此推荐选择EDTA为抗凝剂的采血管（紫帽）作为待提取血样的保存管。

二. 试剂以及方法的学习

1. SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55℃~65℃）条件下可以裂解细胞，使染色体离析、蛋白变性、释放出核酸；

2. 蛋白质、糖、脂类等都可以溶于80%乙醇，而DNA不溶于80%乙醇；

3. 磁珠吸附核酸原理:                                     

（1）磁珠为核壳结构，中心为氧化铁内核，中层包裹封闭基质，外层为修饰的官能团（如图3所示）。

• 中层基质不同，磁珠的基本性质会有所不同；

• 修饰的官能团不同，磁珠的吸附特性会有所不同；

• 即便是相同的封闭基质和官能团，基质的包被工艺不同，会造成基质厚度、孔容、孔径、比表面积不同，所能吸附的颗粒粒径偏好也会有所不同；

• 即便是修饰相同的官能团，官能团修饰工艺不同，会造成官能团密度、臂长不同，所携带的表面电荷、斥力、氢键数量不同，吸附能力也会随之改变；

（2）由于磁珠Buffer一般为聚乙二醇（PEG）等有机溶剂，而这类有机溶剂（PEG沉淀蛋白、沉淀DNA，DNA连接反应中低浓度PEG作为聚合剂，增强载体与目的片段碰撞的机会；PEG还能保持溶液的粘度，使磁珠保持悬浮不易聚沉，也不易造成蛋白变性和非特异性吸附。）分离效果易受PH、温度等影响，温度低PEG也不易与水相完全互溶。

4. 磁珠法DNA提取相对传统酚抽提法、固相载体吸附法优势：

（1）操作简单快速：整个操作流程基本分为五步（裂解、结合、洗涤、干燥、洗脱；图4所示）；

（2）质量稳定可靠：游离的磁珠与核酸的结合量更大，特异性的结合使得核酸纯度更高，且可通过控制磁珠表面基团来调节核酸回收量；

（3）全自动化操作：采用核酸提取仪可实现自动化、高通量操作，一键启动，即可实现几十甚至几百个样品的提取；

（4）安全无毒无害：试剂不含酚、氯仿等有毒化学试剂，完全符合现代化环保理念。

三. 磁珠法全血DNA提取流程

四. 提取过程中注意事项的总结

1. 实验前做好准备工作，准备好仪器、试剂、耗材等；

2. 实验前做好清洁工作：使用75%的酒精擦拭移液枪以及实验台；

3. 预先准备好试剂：如磁珠需提前30min平衡至室温；

4. 预先准备好仪器：提前开启水浴锅，调节好温度；

5. 在EP管盖上的样本编号，字迹要工整清晰，便于识别；

6. 取样前需将采血管上下轻轻颠倒混匀；

7. 裂解红细胞时注意观察样本，若离心后管子仍呈暗红色，需要根据情况适当增加裂解红细胞操作；

8. 实验中的吹打混匀的操作，要确保枪头不要离开液面以下，避免产生气泡；

9. 使用磁珠时，吸取上清的操作中，要注意不要扰动磁珠；

10. 实验中，干燥磁珠时，要注意避免过分干燥，过分干燥磁珠会降低DNA回收得率。

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