做单细胞项目为什么还要做 Bulk-seq | 单细胞专题

单细胞测序能够解决 Bulk 测序无法解决的细胞异质性问题，对于推进医学和生物学研究进展具有极大的促进作用。但是，很多单细胞研究文章，往往不只是采用单细胞测序一种技术，而是联合 Bulk 测序联合，共同解决问题。那为什么单细胞测序和 Bulk RNA-seq会联合一起做呢？

01评估酶解对单细胞表达的影响

在许多单细胞研究中，细胞是通过组织分离（酶消化）和荧光激活细胞分选 (FACS) 来获取，但是酶解对细胞转录组会产生不同程度的影响。Van Oudenaerden et al 发现肌肉组织中分离 SC 细胞亚群过程中，SC 表达谱会发生变化。尽管解离过程影响的亚群可能相对较小，但由于 IEG 和 HSP 基因受到诱导表达增高，在大量研究中会引起强烈的干扰信号。因此需要通过优化实验设计和利用数据分析排除解离诱导基因产生的信号干扰。

为了明确单细胞测序分析结果的准确性，可以利用相同样本的 Bulk RNA-Seq 数据进行评估。Bernard Thienpont et al 采用此方法评估了肺癌组织单细胞数据是否受组织解离影响。作者分析了单细胞测序数据和 Bulk RNA-seq 数据的表达相关性，发现 Van Oudenaerden et al 鉴定的解离诱导基因 Fos、Jun、Socs3、HSPA1A、HSPA1B 等基因在两组测序结果中表达量接近，并且单细胞测序数据和 Bulk 测序数据整体相关性为 0.71，表明单细胞测序整体上没有明显受到前期样本酶解的干扰（图 1）。

但是通过对数据继续分析，发现单细胞测序数据中，免疫相关基因集显著富集，但是上皮、细胞外基质相关基因集缺失（图 2），并且图 1 展示出 CD3D 基因（T 细胞）在单细胞数据中高表达，COL1A1（成纤维细胞）在 Bulk 测序数据中高表达，这些差异反映了组织解离后不同类型细胞解离效率的明显差异，成纤维细胞和内皮细胞比免疫细胞更容易嵌入细胞外基质和基底膜，因此更难解离。

02细胞构成分析

就像做完转录组测序以后要对选定的基因进行 qPCR 验证一样，单细胞测序分析结果，特别是细胞 cluster 构成，最好也可以使用其他技术进行辅助证明。相关技术很多，本篇主要介绍如何利用 Bulk RNA-seq 数据分析样本细胞构成，或者基于表达模式相关性分析辅助证明单细胞测序结果。
方法 1：利用二次规划（quadratic programming）算法，分析 Bulk RNA-seq 数据中不同细胞类型的构成比例，并与单细胞测序结果相比较、验证（图 3）。

方 法 2：利 用 反 卷 积 算 法， 调 用 Bulk 数 据 中 免 疫 细 胞 比 例， 常 用 的 工 具 包 括CIBERSORT、EPIC 等。其中 CIBERSORT（https://cibersort.stanford.edu/）功能更为强大，对未知混合物和含有相近的细胞类型的表达矩阵的去卷积分析优于其他方法 (LLSR、LLSR、PERT、RLR、MMAD、DSA)。CIBERSORT 是基于线性支持向量回归的原理对免疫细胞亚型的表达矩阵进行去卷积的一个工具，可用 RNA-Seq 的数据来估计免疫细胞浸润情况。用户只需要注册一个账号，就可获得 500M 存储数据和结果的空间。操作时，只需上传标准的表达矩阵文件即可，能够分析 T 细胞（CD8+T 细胞、naïve CD4+T 细胞、Tregs 等）、B 细胞（naïve B 细胞、记忆 B 细胞）、巨噬细胞、粒细胞、树突细胞、肥大细胞、NK 细胞等 22 种免疫细胞构成比例（图 4）；如果想要分析包含其他细胞类型的浸润比例，则需按照官网提示的格式上传相应的文件。

方法 3：单细胞测序结果中，聚类得到的不同 Cluster 代表不同细胞类型，对不同Cluster 定义完成以后，可以分析不同 Cluster 与对应的特定细胞 Bulk 数据的相关性，或者通过随机森林法将特定分选细胞 / 特定发育阶段 Bulk 数据映射到不同的细胞 Cluster，明确单细胞聚类及定义的准确性（图 5）。

03对特定细胞表达谱进行分析（后期验证）

做完单细胞测序以后再开展 Bulk 测序在很多文章中常见，当然，除了 Bulk 测序以外，还有可能是 SMART-seq 或者 Fluidigm C1 单细胞测序。不管是采用何种测序手段，目的都是为了验证 10X 单细胞结果中特定细胞群体的基因表达模式。Sherene Loi 对 6311 个CD3+CD45+T 单细胞转录组测序，共获得 10 个 Clusters，其中 CD8+CD103+T 细胞（CD8+TRM），其具有组织驻留记忆 T（TRM）细胞分化的特征，并高表达免疫检查点分子和效应蛋白，具有细胞毒性和促炎潜力，通过分选 CD8+CD103+T 细胞和 CD8+CD103-T 细胞并做 Bulk 测序，在 CD8+CD103+T 细胞中，发现组织特异基因 S1PR1 和 KLF2 的表达显著降低，而PD1和CTLA4等免疫检查点显著升高，表明CD8+TRM细胞有助于BC免疫监视，并且是免疫检查点抑制调节的关键目标。

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