用于植物单细胞核RNA测序的根细胞核分离方法 | 单细胞专题

上篇文章（植物单细胞核测序-让植物scRNA-seq不再受困于原生质体制备 | 单细胞专题）中提到，植物组织和植物细胞开展单细胞测序面临挑战：

1、植物细胞被固定在刚性细胞壁基质中，分离单细胞时需要将其移除；

2、植物细胞壁的酶消化是一种重要的胁迫源，容易刺激植物细胞出现应激反应，诱导压力应答基因的表达，人为引入转录偏差；

3、植物原生质体大小存在可变性（渗透压导致的原生质体胀大）；

4、质体细胞器、和液泡中存在可与RNA相互作用的次级代谢物；

5、 不同组织类型间适用的酶组合不同，需要优化消化细胞壁所需的酶；

制备的原生质体很脆弱，活性波动大。

而植物开展单细胞核测序，可以较好地克服上述困难。本文整理了适配10X Genomics Chromium平台的植物根单细胞核抽提详细方法，供参考。

01拟南芥种子灭菌与种植



材料



MS培养基配方

a) 440mg MS盐

b) 50mg 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，pH 5.8

c) 500mg 葡萄糖

d) 600mg 琼脂糖

e) 100ml去离子水

注：高压灭菌后冷却到65°C，然后浇注到培养皿，待培养基聚合后，可以在4°C保存2天。

操作流程

1. 将400粒左右的种子放入2毫升Eppendorf管中；

2. 加入1 ml 70%乙醇，在试管旋转器中低速旋转震荡5分钟(25 rpm)；

3. 除去上清液，加入1ml含0.01% Triton X-100的次氯酸钠（4.125%），试管旋转器中低速旋转震荡5分钟(25 rpm)；

4. 转移试管到超净工作台；

5. 让种子沉淀到试管底部，移除上清液；

6. 加入1毫升无菌去离子水，吹打混合两次；

7. 重复步骤5和步骤6四次；

8. 移除多余的水后放在超级工作台准备播种；

9. 准备高压灭菌的MS培养基；

10. 在超净工作台内将约30ml MS的培养基倒入直径为100mm的培养皿中，等待凝固；

11. 用200μl针尖播种两行（间隔3厘米），每行播种约150颗种子；

12. 封口膜密封培养皿，4℃避光保存2天低温春化；

13. 2天后，将培养皿垂直放置在光照培养箱(设置:25℃, 16/8小时光/暗循环)培养7天。

02拟南芥细胞核分离



材料

NIB（Nuclei isolation buffer）配方

a) 500μl CelLyticTM PN分离/提取缓冲液（MilliporeSigma，货号：CELLYTPN1）

b) 1.5ml RNAse-free 水

c) 使用前新鲜配置

操作流程

1、将500μl NIB培养基加入到一个新的、无菌的、预冷的60mm培养皿中。

2、从7天生的拟南芥植株(图1A)中收集新鲜的根：用剃须刀片将根从植株的地上部分分离出来；

3、用镊子将根转移到60毫米的培养皿中(图1B)，确保根浸润到NIB培养基中（注意不要有植物地上部分残留）；

4、用剃须刀把根切碎，约切5分钟；

5、如果需要，可以额外添加NIB培养基以保持根组织湿润(图1C)；

6、在摇床上4℃孵育15分钟；

7、50ml 的Faclon管置于冰上，3 0上套40um滤器后安装在管口；

8、在过滤核悬液之前，先用500μl NIB对滤器进行预湿。将管稍微倾斜 (图1D)；；

9、使用宽口枪头慢慢吸取切碎的根/NIB混合物到预湿的滤器上；

10、使用宽口枪头吸取500ul NIB，慢慢冲洗培养皿收集剩余细胞核；

11、吸取冲洗液加入到滤器上进行过滤。

图1

03流式分选纯化



目的

尽量减少细胞器对拟南芥根细胞核悬浮液的污染，清除其他污染物(如细胞碎片)，并防止10×仪器启动捕获细胞时出现管道堵塞。

材料



PBS+配方

a)   3.9ml不含钙镁离子的PBS(Corning, 货号：21-040-CV)

b)   20μl RNase抑制剂，4u /μl（Roche，货号：03335399001），终浓度0.2 U/μl

c)   80ul超纯BSA，50mg/ml（Thermo Fisher Scientific，货号：M2616)），终浓度0.1%（W/V）

d)   使用前新鲜配置

操作流程

1、分选前将BD FACSAria II型细胞分选仪的样品室和分选收集装置预冷至4℃

2、将200μl过滤后的细胞核转移到一个流管中，通过其滤帽作为一个非染色对照（作为细胞核分选的基线）；

3、用碘化丙啶(10μg/ml终浓度)对剩余样品进行染色；

4、分选前置于冰上10min；

5、分选样本，分选仪使用100 nm喷嘴，默认压力为20 psi；

6、用488 nm激光器激发碘化丙啶，并使用600 nm高通滤波器和610/20 nm带通滤波器组合检测；

7、收集已分选的细胞核，置于15ml锥形管中，加入1ml PBS+后置于冰上。

8、分选结束后4℃ 1000g离心10min（此步骤和后续步骤需要去掉缓冲液中的二价离子）；

9、去上清后添加3ml PBS+，轻轻重悬细胞核（为了防止核膜渗漏，强烈建议用轻旋法而不是移液法来重悬细胞核。在荧光显微镜下，碘化丙啶或DAPI染色可以很容易地检测到受损的细胞核，但是离散泄漏无法检测到）；

10、4℃ 1000g离心10min；

11、去上清后添加30-100 ul PBS+，轻轻重悬细胞核；

12、使用血细胞计数版和强光显微镜检测细胞核浓度，必要时调节PBS+体积。

04Countess II自动细胞计数仪计算细胞核密度



材料

0.4%台盼蓝染料

Countess II自动细胞计数仪

Countess II FL载玻片

1 ml Eppendorf管

10 ul枪头（Rainin）

操作流程

1、使用200ul 带滤网宽口枪头将9μl核悬浮液转移到新的试管中；

2、加入1μl 0.4%台盼蓝；

3、轻弹试管进行混合，避免细胞核聚团；

4、在CountessTM II FL载玻片上滴加10μl 细胞核悬液；

5、选择直径在2-15μm之间、台盼蓝阳性的细胞核，计算细胞核浓度。

参考文献

Thibivilliers, S., Anderson, D., & Libault, M. (2020). Isolation of plant root nuclei for single cell RNA sequencing. Current Protocols in Plant Biology, 5, e20120. doi: 10.1002/cppb.20120

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