微量RNA检测为何芯片远远优于测序？联川14年资深研发人员如是说

近年来，随着二代测序技术的不断进步和成本的不断下降，曾经甚嚣尘上的芯片与测序之争，结果貌似越来越明显。二代测序以其开放性，无物种限制及对未知序列的分辨等优势，将芯片远远的甩开，在基因研究方面基本上是一枝独秀。

笔者作为资深实验狗，入行十年来不断在芯片和测序战场上来回转战，对两种技术在操作层面上算是比较熟悉。笔者也认为，目前来说，测序和芯片相比优势很大，种种优势在此不再赘述。

不过，今天，笔者要说的是根据自身实操上万例的测序建库和芯片实验总结出来的芯片方面目前还有的一些优势。主要是针对一些微量样本的实验。

出现微量RNA样本存在两种情况，一种是样本本身量就少，比如研究某个特殊的结构，其组织量极少，或者有限的组织样本却要做多种不同的实验等情况，另外一种则是样本特殊，比如血清血浆外泌体等，血清血浆外泌体等类型的核酸含量极低，且个体差异大，1毫升血清血浆提取得到的RNA，可能从几ng到几十ng之间，而这个数据可能因为浓度已经超出定量仪器的最低量程，实际上比你得到的数据，真实的量可能更低，而从几十毫升细胞上清或者尿液中提取得到的外泌体RNA，可能还赶不上1毫升血清血浆得到的量。

而血清血浆外泌体等特殊样本中的RNA，除了量少，而且还比较碎，以bioanalyzer 2100 进行质检，基本上只能看到比较小的片段（＜500nt）

血浆样本RNA的2100质检图例

近年来，笔者在科研服务中也做了成百上千例微量样本。总结来说，微量样本除了在miRNA研究上测序略胜一筹外（miRNA测序也是采用了比较特殊的建库方式），其他mRNA，lncRNA，circRNA等方面，测序是比不上芯片的。

RNA-seq建库过程比较复杂，加接头，纯化等各种操作会出现损失，根据笔者的经验，1ug的动物total RNA，进行polyA-RNA的转录组文库构建，最终得到的文库量约300-1000ng，以1ug的动物total RNA中含polyA-RNA 1%-3%计算，实际上整个建库过程中样本的扩增倍率大约在100倍以内。

普通的微量样本，需要先进行polyA抓取或者rRNA去除，经过这些操作后，再进行建库，得到的文库往往不足以进行后续的测序分析，而且即使得到足够的文库，最后的数据中容易出现大量的接头自连产物，造成大量数据浪费。

而特殊的微量样本，如血清血浆外泌体等，除了普通微量样本的情况外还往往含有许多来源不明的杂质（如细菌等），结果往往是测得一堆无法进行后续分析的数据。

且面对上述RNA含量极少的样本，为了得到足够测序的文库，建库时往往要增加PCR循环数，这样就可能造成因PCR偏好性造成的数据不准确。

而在芯片检测实验中，首先，非芯片探针能涵盖的片段，在芯片中是无法被检出的，这就排除了样本中接头和杂质的干扰。

其次，以Agilent的表达谱芯片为例，其扩增标记方式为T7体外转录扩增法，中间的操作过程较少（仅两个步骤和一次纯化），这种扩增方式属于线性扩增，对数据的真实性保障比较好，而且在扩增过程中加入梯度spike in RNA，可以在最后的芯片结果中检测其扩增的线性情况。以笔者的经验，以oligo dT为引物以Agilent芯片的扩增标记试剂盒对RNA进行扩增时，其扩增倍率普遍可以达到1000倍以上，如100ng total RNA起始，可轻易得到2-4ug的polyA RNA扩增标记的cRNA产物。笔者在实验中发现，10ng的血清血浆外泌体RNA，以6N随机引物进行扩增标记，在扩增的线性范围内，得到约2ug足够进行芯片杂交的扩增产物成功率,几乎可以达到100%。极限情况下，低于1ng的样本，适当的调整实验条件，成功率也能达到80%以上。

作者简介

梁洪，联川生物资深实验员，现为研发部PCR高级研发工程师，在基因芯片和高通量测序领域拥有超过13年的工作经验，熟练掌握多种芯片平台（安捷伦表达谱芯片、昂飞表达谱芯片、联川微流控小RNA芯片等）的操作方法，并对各自性能优劣有着充分对比。2008年开始，为国内第一批接触高通量测序的”资深玩家“。梁洪根据自身多年生产经验，申请了一系列芯片与测序的相关生产工艺改良专利，在公司内部被诸多后浪们尊称为梁哥，擅长解决各种芯片和测序的相关问题。

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