综述解读：RNA表观修饰在大脑疾病和行为控制中的作用

摘要：

自从1957年第一种RNA修饰被发现以来，我们对RNA代谢的理解取得了很大的进展。许多修饰主要存在于非编码RNA中，但是目前兴趣主要集中在编码RNA上。在这里，我们总结RNA修饰的细胞学影响，特别是在神经精神疾病方向。我们证实了“RNA编码”的存在，类似于组蛋白密码，通过使用不同的RNA修饰来微调神经系统中基因的表达。不同于相对稳定的基因表达，RNA表观遗传学编码，又称为表观转录，可能作为精神疾病的起因或者结果，是一个动态的过程。我们讨论了表观转录的失调和大脑疾病之间潜在的连接机制，并确定了潜在的新的研究方式。

关键词：表观转录；神经精神疾病；RNA修饰

1. 前言

RNA编码和解码生物体生存所必需的信息。细胞有机体利用信使RNA（mRNA）指导蛋白质的合成，这是通过核糖体来实现的通用功能。转运RNA（tRNA）将氨基酸传递到核糖体，然后核糖核酸酶P将氨基酸连接在一起生成蛋白质。随着多细胞有机体越来越复杂，RNA功能不断扩展，精细调控RNA的需求也随之出现。调控RNA的一种机制是直接通过化学修饰。这里，我们探究了RNA修饰和在大脑与行为之间的关系。

已经确定DNA中的4种主要的核苷酸被广泛地修饰，具有广泛复杂的功能性细胞学影响。自从60年前在tRNA中发现假尿苷以来，又发现了超过100种RNA修饰，远远超过了天然存在于DNA中的修饰。最近越来越多的证据表明RNA修饰的功能性效应和DNA和染色质中的修饰一样复杂。此外，DNA和染色质表观遗传可以通过不改变遗传密码的方式进行修饰，是利用称为“writers”和”erasers”的两种酶来实现的。RNA修饰构成了表观遗传调控的高度动态层（如下图1）。早期的RNA修饰研究主要集中在非编码RNA（ncRNA）上。这些研究表明RNA修饰在翻译和剪切过程中至关重要。例如tRNA中的N1甲基腺苷（m1A）修饰可以稳定tRNA的结构和通过调控tRNA和多核糖体的连接来影响翻译。Sn RNA中的假尿苷（Ψ）可以微调mRNA的剪切，然而rRNA中的假尿苷（Ψ）可以调节内部的核糖体进入位点（IRES）的使用，确保翻译的准确性。tRNA中的5甲基胞嘧啶（m5C）可以维持反密码子的茎环构象。最广泛的RNA修饰之一是位于mRNA 5’和一些长链非编码RNA（lncRNA’s）的末端的7-甲基鸟苷修饰，所谓的5‘帽子结构，在RNA稳定性和翻译方面有重要的作用。

最近，mRNA上又鉴定了许多新的化学修饰，包括N6甲基腺苷（m6A），5-甲基胞嘧啶（m5C），5-羟甲基胞嘧啶（hm5C），肌苷（I），假鸟苷（Ψ），N1-甲基腺苷（m1A）。利用高通量测序策略将mRNA和lncRNA上的修饰定位到整个转录组中。其中一个研究最多的RNA修饰是m6A，它其实是几十年前发现的，但直到最近它的许多功能仍然未知。m6A存在于许多类型细胞的整个转录组中，在RNA的稳定性、翻译、剪切、和二级结构方面具有重要的作用。最近的研究揭示了其他的mRNA修饰的重要功能，包括假鸟苷（Ψ）介导的翻译通读，m1A相关的翻译调控和肌苷（I）诱导的重新编码。将RNA修饰对转录和翻译的影响联系起来的研究称为“表观转录组”。

2.RNA修饰

2.1 N-6甲基腺苷（m6A）

自从发现FTO（脂肪量肥胖相关）蛋白是一种m6A甲基化转移酶，m6A修饰的功能及在疾病病因中的潜在作用引起了较多的关注。甲基化的腺苷占总RNA转录本中的0.2%,相当于2000bp个碱基中有一个m6A，，这意味着1个动物mRNA转录本中有1个或2个m6A。m6A主要位于终止密码子附近和长的外显子内部，而非起始密码子，符合其调控mRNA半衰期的功能。同时，m6A改变RNA折叠和结构，通过5’帽子结构，多聚腺苷和剪切来参与RNA的成熟。m6A促进细胞定位和mRNA核输出。

2.2 1-甲基腺苷（m1A）

RNA修饰m1A是很多年前发现的，它主要存在于rRNA和tRNA中，维持三级结构和影响翻译。m1A被发现存在于转录本所有的区域，包括CDS区，5’和3’UTRs。mRNA分子中被发现包含m1A，然而它的功能鲜为人知。m1A可以通过降低释放因子的结合来增加mRNA的翻译，或者通过破坏翻译起始位点的RNA折叠来增强翻译。

2.3 5-甲基胞嘧啶（m5C）

5-甲基胞嘧啶（m5C）通常存在于DNA中，但是也存在于RNA中。m5C主要存在于mRNA的UTRs和Argonaute的结合位点附近，Argonaute是RNA降解机制的一部分。类似于m6A，m5C修饰也是动态的，但是不同于m6A，m5C不能被去除，而是被氧化成5-羟甲基胞嘧啶（hm5C）。hm5C倾向于存在于多聚核糖体中，并与果蝇的翻译增强有关。

2.4 假尿苷（Ψ）

假尿苷（Ψ）是被发现的第一种RNA修饰，它曾经被错误为第五种碱基。Ψ是尿苷的异构体，不影响Watson-Crick的碱基互补配对。Ψ是由两种酶作用生成：H/ACA box snoRNAs和假尿苷生成酶（PUS）。Ψ在tRNA和rRNA中尤其丰富，但是在snRNA中也存在。通过高通量测序技术在真核生物mRNA中定位了Ψ。Ψ是通过环境因素在细胞水平上起始形成的，被认为是一种不可逆的RNA修饰。Ψ在mRNA的稳定，细胞内转录本的定位和翻译终止过程中有重要的作用。

2.5 Queuosine (Q)

Queuosine (Q)是一种7-脱杂尿苷核苷，通过酶法加到特定的tRNAs上的。在真核生物中，queuosine的产生始于日常饮食或者微生物群产生的queuine碱基。通过tRNA-鸟嘌呤糖苷转移酶，对喹因进行修饰，并添加到转录组后的RNA中。小鼠中TGTase基因的损坏损害苯丙氨酸产生酪氨酸的能力，可能影响多巴胺类等单胺类神经递质的产生。在多发性硬化的小鼠模型中，最近有证据表明喹因并入到tRNA中，有助于这种疾病弥散性的脑脊髓炎。在动物模型中，tRNA的修饰诱导多发性硬化症的缓解。由于喹因大部分在肠道中产生，但在大脑中利用，关于喹因修饰的RNA在肠道-大脑系统信号中潜在作用的假说应运而生。未来的研究也许能阐明这种有趣的可能性。

2.6 RNA编辑（RNAediting）

RNA编辑首次被发现是因为线粒体氧化镁2的转录本序列和对应的DNA序列的不一致。最常见的替换是腺苷到肌苷，这种替换导致I-U不匹配，翻译机制将其识别为尿苷，导致A到G的突变。mRNA编辑可以显著改变翻译蛋白质的特性。一个例子是AMPA(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸)谷氨酸受体亚单位GluR2。在这种情况下，mRNA编辑将谷氨酰胺转化成精氨酸，随后改变AMPA受体钙离子通透性。

2.7 环状RNA（Circular RNA）

另一种备受关注的RNA修饰是环状RNA（circ RNAs）,它是由5’和3’末端连接而成的单链RNA分子。哺乳动物circ RNAs是通过“backsplicing”的方式生成，3’外显子和同一转录本5’的上游连接在一起形成的。本综述特别关注的是，circ RNAs主要在大脑区域中大量存在。在神经元中，突触小体内发现了大量的circ RNAs。circRNAs明显比线状RNA稳定，因此他们的半衰期更长。最近的研究表明circ RNAs和线性RNA的作用大不相同。例如，最近的研究表明，circRNA Cdr1as仅在大脑中表达，且有超过70个miR-7结合位点，反过来又调控大脑中的其他基因。CDR1as可能像海绵一样作用于miR-7，具有Cdr1as基因损坏的动物在神经传递方面又缺陷。

2.8 RNA修饰和RNA编码（RNA modification cross-talk and the RNA code）

单个RNA分子上存在多种修饰的可能性暗示了一种精细的功能调控的可能性。可逆和不可逆的RNA修饰的组合，修饰4种主要的初级核糖核苷酸，tRNA, rRNA, mRNA, lncRNA, snoRNA和其他RNA种类的修饰，可能产生无限的RNA组合。这复杂性存在的证据正在积累。m6A定位识别包括circRNA的m6A位点，其中许多表现出细胞特异性表达模式。有意思的是，circRNAs是由和mRNA中相同的蛋白来“写”和“读”m6A，但是在circRNAs中,m6A的模式和定位和mRNA中完全不同。另外一个RNA编码复杂性的例子是在酵母中发现的，tRNA中的奎因修饰可以增强5-甲基-胞嘧啶酶DNMT2的活性，随后又可以甲基化其他的tRNA。如下所述，需要更多的发现来破译RNA编码，但这些将不得不等待新的单分子测序技术的发展。

3.WRITERS,READERS AND ERASERS

正如我们在上一节里所述，许多RNA修饰显著地改变RNA的生命周期，进而动态地调控转录组。然而RNA修饰有很多种类，不同种类的分子机制也有所不同，这些催化RNA修饰和识别及清除RNA修饰的蛋白可以归类为writers、readers和erasers。在接下来的章节中，我们主要关注mRNA m6A修饰的酶促机制（如图2）。

3.1 writers

METTL3 and METTL14: N6-甲基腺苷（m6A）是通过一个包含METTL3, METTL14, WTAP, KIAA129 and RBM15的甲基化转移酶复合体来加入的。M6A碱基可以被RNA结合蛋白识别或者被去甲基化酶清除。mRNA中腺嘌呤的甲基化是被一个包含METTL3（也被称为MT-A70, MTA and IME4）和METTL14的甲基化转移酶实现的。

3.1.1 辅助蛋白（WTAP and KIAA1429）

Wilms肿瘤1相关蛋白和与可变剪切相关的Wilm肿瘤抑制基因（WT1）。在植物中，WTAP和METTL3相关，METTL3可以促进m6A的产生。KIAA1429是最近被报道的另一种甲基化相关的酶，被认为是甲基化转移酶复合体中的一种重要的组成部分。m6A 甲基化转移酶复合体成分METTL3, METTL14, WTAP, Vir and RBM15在真核生物中高度保守，而不是在在酵母和线虫中。

3.2 readers

Reader蛋白的主要作用是微调甲基化的转录本。这可能是通过阻止writers和erasers接近修饰的碱基或者招募别的RNA结合蛋白来促进RNA的化学修饰。

3.2.1 包含YTH 结构域的蛋白

YTH(酵母双杂克隆521-b同源物)结构域包含被认为是m6A readers的蛋白，这些蛋白因为他们对甲基化的RNA具有高的亲和性。这个蛋白家族中包含几个已知的蛋白，如YTHDC1/2 和YTHDF1/2/3。敲除YTHDF2可能影响mRNA的降解，YTHDF2与m6A的结合与mRNA的定位和/或者降解紧密相关。YTHDF2还在5’UTR周围保守的甲基化中发挥重要作用。然而，在受到外部胁迫后，可以被FTO去甲基化的m6A，可以被YTHDF2结合保护以促进非依赖于帽子结构的翻译起始。

3.2.2HNRNPC, HNRNPC HNRNPA2B1 和eIF

NHRNPC是一种高丰度的RNA结合蛋白，NHRNPC通过m6A与RNA结合影响mRNA转录组的可变剪切。HNRNPG可能也与RNA的代谢调控有关。另外，真核生物起始因子（eIF3）蛋白结合5’UTR附近的m6A位点进而调控翻译起始。

3.3. Erasers

RNA上的m6A可以被ALKB家族蛋白酶促可逆地转化成腺苷。迄今为止，仅在高等真核生物体中报道了去甲基化酶，在低等真核生物中没有发现。

3.3.1 FTO（脂肪量相关蛋白）和ALKBH5

敲除FTO可以显著增加m6A甲基化，过表达FTO可以降低m6A甲基化。类似于FTO，ALKBH5是具有去甲基化酶活性的ALKB家族成员。类似于FTO，ALKBH5蛋白水平的改变对m6A甲基化水平有显著的影响。

4.脑疾病和神经行为

RNA修饰是特定类型脑癌的病理病因。然而，RNA修饰与神经精神疾病的关系的研究才刚刚开始。

4.1脑癌

M6A修饰的RNA在脑癌中有重要的作用。最近一项研究使用来自多形性胶质母细胞瘤的干细胞（来自胶质母细胞瘤的干细胞；GSCs）发现ALKBH5水平升高是胶质母细胞瘤进展的可靠预后指标.。本研究还确定了ALKBH5在GSCs自我更新能力中的功能作用。另一项研究报道miR-29a抑制GSCs的侵袭和迁移。Quaking（QKI）基因促进中枢神经系统髓鞘形成，当QKI被Mir-29a抑制时，PI3K/AKT和ERK通路对GSCs的迁移和侵袭有重要的抑制作用。

4.2 神经发育和神经退行性疾病

FTO一种是催化N-6-甲基腺苷去甲基化酶的脂肪量和肥胖相关基因，它最初是在融合趾（Ft）突变小鼠中发现的。FTO在神经系统的发育过程中发挥着重要的作用。有Fto基因座缺失的小鼠胚胎表现出脑模式异常，包括有缺陷的端脑和下丘脑发育。FTO基因的遗传突变和阿尔兹海默症有关，在阿尔兹海默症中，FTO的表达显著降低。在一项流行病研究中，也将FTO与阿尔兹海默症联系在一起。

众所周知，tRNA分子经历广泛的转录组后修饰，这些修饰可能导致脑功能障碍。人类中可以催化tRNA中尿苷双甲基化的tRNA甲基化转移酶的失活可以引起认知紊乱。假尿苷酸酶（Pus3）,可以催化某些tRNA中尿苷异构化为假尿苷，它的失活与智力障碍有关。

最近，激酶相关的内肽酶（KAEI）作为tRNA N6苏氨酰氨基甲酰腺苷（t6A）修饰的生物合成途径中的一部分，它的突变与神经退行性疾病相关。

最近许多研究表明延伸复合物，是由6种ELP蛋白组成的多亚基蛋白复合体，在tRNA尿苷修饰中有着重要的作用。这些亚基之一的ELP2的突变与神经发育障碍有关。在可能扰乱神经元迁移的非典型罗兰癫痫患者中发现了ELP4突变。最后，ELP3的遗传变异与进行性运动神经元疾病肌萎缩性嵴髓侧索硬化症有关。

M5C酶的突变与神经系统疾病有关。例如，甲基化几种tRNA的m5C RNA甲基化转移酶Nsun2和Dnmt2的突变，与神经系统紊乱有关。Nsun2的遗传变异也与智力障碍有关，例如在类似Dubowitz的综合症中看到的。

如前所述，mRNA编辑由称为ADAR的腺苷脱氨酶家族催化。然而，ADAR也可以编辑tRNA。异二聚体腺苷脱氨酶（hetADAT）催化某些tRNA的腺苷转化为肌苷。在遗传性智力障碍的家庭中发现了一个hetADAR亚基ADAT3的突变。

4.3 RNA修饰与记忆

目前，许多研究表明DNA或者组学修饰在记忆形成方面有重要作用。然而，RNA修饰也参与基因形成。例如，FTO表达减少可以增强恐惧记忆。毫无疑问，许多其他例子等待被发现。

4.4 抑郁症中的RNA修饰

已经在包括重度抑郁症的精神疾病中发现了FT0的多态性。在一项研究中，发现携带FTO rs9939609等位基因的个体的肥胖风险与抑郁症呈负相关。另一项研究发现MDD与alkbh5109等位基因变体之间存在关联，这与m6A修饰的mRNAs与焦虑和认知障碍相关的数据一致。在自杀完成者的大脑中检测到导致5-HTR2C信号受损的5-羟色胺受体2C（HTR2C）mRNA的修饰。

4.5 成瘾中的RNA修饰

诸如药物相关的环境因素和遗传因素对人类行为，如吸毒行为有很大贡献。大脑中FTO的高表达和肥胖相关的基因变异增强了人们对FTO在食物相关的行为中的作用的兴趣。

影像学研究表明胰岛素敏感性以及FTO和Taq1A(ANKK1)变异的贡献与多巴胺受体介导的机制相关。其他研究也表明在伏神经核中FTO 和ANKK1变异与降低的D2受体密度有关。

在老鼠身上，D2型神经元中FTO的缺失减弱了急性可卡因治疗后G蛋白偶联的内向整流钾（GIRK）通道的电导。通过免疫沉淀测序免疫沉淀的m6A修饰的RNA显示许多与FTO中多巴胺信号传导相关的转录物中m6A甲基化增加缺陷小鼠和证实了这些蛋白质表达水平的改变。总之，这些研究表明RNA甲基化中的表位转录组改变启动和/或加强成瘾周期。

5.未来展望

过去十年中产生的许多关于RNA修饰的功能作用的信息依赖于新的RNA测序技术，如转录组范围内的m6A图谱。基于这些图谱的功能研究直接与分子变化有关，影响mRNA的剪切、输出、翻译、稳定性、结构和mRNA的生物合成。

为了深入研究RNA修饰的功能，需要新的技术。目前的测序技术主要基于抗体，因此不能提供RNA修饰的直接读出。例如，已知m6A特异性的抗体对特定的RNA序列和二级结构具有内在偏好性，且不能区分m6A与其他一些修饰的核糖核苷。基于抗体的RNA测序方法需要事先了解修饰的核糖核苷酸，从而阻碍了发现新的RNA修饰。

由于缺乏优化的检测方法，对m5C，Ψ，hm5C和m1A等mRNA的动态化学修饰的生物学功能知之甚少。对于m5C检测，RNA亚硫酸氢盐测序可以以单核苷酸分辨率检测内源性m5C位点。但是，准确的碱基检出需要极高数量的测序读数，这使其成为一种非常昂贵的方法。此外，亚硫酸氢盐处理导致显著地RNA降解，这可能改变二代测序中的转录信息。胞嘧啶的不完全亚硫酸氢盐转化可能引入偏好，并且其他RNA修饰也可能被转化产生假阳性。未来需要开发更灵敏和更准确的m5C检测方法。对于Ψ检测，目前的测序方法已经实现了单碱基RNA分辨率，但是由于苛刻的化学处理而导致显著地RNA降解。对于hm5C和m1A检测，目前的测序技术尚未达到单碱基分辨率。迫切需要在测序方法学方面取得重大进展，以更好地检测和功能分析这些RNA修饰。

接下来，新一代测序技术最初设计用于测序DNA，并且最近已被重新用于测序RNA。理想情况下，一项成功的技术将有较长的读长，且能够对单个RNA分子上的多种修饰进行鉴定。有关这些技术的最新综述，请参阅Jonkhout等人。单分子RNA测序最有前途的方法之一是纳米孔测序，它利用当RNA分子通过微孔时的电流变化对碱基实时监测。16secondsRNA的第一次纳米孔测序显示低碱基调用准确度（＜90%）和非常低的通过量（～100万个序列读取）；https://nanoporetech.com/)。新的更灵敏的碱基检测方法；更严格调节的纳米孔和更好的碱基调用算法无疑将改善这些结果。

随着越来越多和更好的表观转录组测序技术的发展，将需要分析大型测序数据集。需要新的生物信息学工具来补充当前的数据分析规则，这些规则最初设计用于分析染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据。这些新工具将需要考虑可变剪切导致的复杂性，逆转录过程中诱导的扩增偏好，以及在整个转录组中同一RNA分子内的多个RNA修饰。应建立一个用于管理和共享表观转录组数据的综合数据库，以标准化不同研究中使用的实验和计算程序。我们预计，在不久的将来，将有许多新的分子和生物信息学工具可用于促进快速发展表观转录组学领域。

参考文献：

Y. Jung and D. Goldman .(2018). Role of RNA modifications in brain and behavior. Genes Brain Behav. 2018 March ; 17(3): e12444. doi:10.1111/gbb.12444.

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