万字长文解析m6A及非编码RNA与肿瘤干性调控关系 | m6A专题

转载自：生信人

The interplay between m6A modification and noncoding RNA in cancer stemness modulation: mechanisms, signaling pathways, and clinical implications

m6A修饰和非编码RNA在肿瘤干性调节中的关系：机制、通路及临床意义

m6A、ncRNA以及肿瘤干性今年来的研究热度不断上升，作者根据最新的研究进展将三者间的相互作用关系进行了综述。文章内容较多，为便于阅读，本文相较于原文有所删减和调整。即便如此，篇幅依然较长，小伙伴们可以按需、按兴趣选择性阅读相应部分。

摘要：肿瘤干性在肿瘤进展中发挥重要作用，是近年来肿瘤研究中的热点之一，是导致放化疗耐受、肿瘤发生、转移、自我复制、代谢重编程以及免疫微环境改变的重要原因。但是具体的机制尚不清楚。大量的研究表明ncRNA在肿瘤干性的调节中起到重要的作用。m6A修饰对于RNA（包括ncRNA）发挥生物功能，包括RNA的剪接、稳定、翻译、降解和输出等方面，具有重要的意义。证据表明m6A可以控制ncRNA的表达和功能，从而调控肿瘤干性。但是肿瘤干性调控中的ncRNA和m6A的关系却极少研究，这篇综述介绍了近期关于m6A、ncRNA和肿瘤干性相关的研究和发现。通过对Wnt/β-catenin、MAPK、Hippo以及JAK/STAT3等通路的研究，试图寻找m6A和ncRNA在肿瘤干性中潜在的交互作用机制。值得指出的是ncRNA和m6A修饰分子潜在的临床价值，在众多癌种中具备作为肿瘤干性标志物、治疗靶点的潜力并有助于提高诊断的准确性。

关键词：N6-甲基腺苷（m6A）修饰，非编码RNA（ncRNA），肿瘤干性，信号通路，生物标志物

1、介绍

N6-甲基腺苷（m6A）是真核mRNA中最普遍的修饰，调节RNA稳定性，剪接，降解，翻译和输出等。m6A修饰的功能受三个同源因子的控制，包括“writers”，“readers”和“erasers”。

m6A“writers”：可以催化RNA上腺苷的m6A修饰，主要包括甲基转移酶样3蛋白（METTl3），甲基转移酶样14蛋白（METTl14）和WT1相关蛋白（WTAP）。m6A“writers”还含有RNA结合域蛋白15/15B（RBM15/15B），甲基转移酶样16（METTL16），含锌指CCCH型13（ZC3H13），以及Vir样m6A甲基转移酶（VIRMA，又称 KIAA1429）等等。

m6A“erasers”：主要包括FTO和ALKBH5。这些蛋白质可以从RNA中除去甲基化，这意味着m6A修饰是动态和可逆的。

m6A“readers”：选择性RNA结合蛋白，其可以识别m6A，其主要包括含YT521-B同源性（YTH）结构域蛋白家族（包括YTHDF1/2/3等YTHDFs，以及YTHDC1/2等YTHDCs）。另外的reader包括胰岛素样生长因子-2 mRNA结合蛋白（包括IGF2BP1/2/3的IGF2BPs），不均一核糖核蛋白（HNRNP）家族（包括HNRNPA2B1，HNRNPC和HNRNPG）和NF-κB-相关蛋白（NKAP）和真核转换起始因子3（eIF3）（图1）。

m6A修饰富集于共识序列RRACH（其中R：A或G和H：A，C或U）和3'未翻译区域（3'-UTR），终止密码子以及内部的长外显子。

图1

非编码RNA通常缺乏对蛋白质进行编码的能力，在本综述中，我们主要关注miRNA，lncRNA和circRNA，其可以介导的细胞过程包括转录，染色质重塑，转录后修饰和信号转导。miRNA是一类非编码单链RNA，长度为21-25个核苷酸。通过形成RNA诱导沉默复合物（RISC）来调节转录后水平的基因表达，并导致翻译抑制或mRNA降解。lncRNA是一种含有超过200个核苷酸的RNA，缺乏编码能力。据报道，lncRNA可以顺式或者反式调节基因表达。circRNA是一种单链闭合环状RNA，其缺乏5'-3'末端和polyA尾。circRNA的功能主要包括结合miRNA或蛋白质，调节转录，干扰剪接和翻译多肽。

肿瘤干细胞是肿瘤干性的重要来源，它们具有自我复制，分化和增殖的能力。肿瘤干细胞应使肿瘤细胞能够自我复制产生新细胞。干细胞层次的自我复制能力是可变的，这涉及到非常复杂的过程，并且可能是难以识别和消除肿瘤干细胞的原因。肿瘤干性可能是肿瘤复发，转移和耐药性的最重要因素之一。研究表明，肿瘤干细胞的行为如复发，转移和耐药性与肿瘤进展相关，因此靶向肿瘤干性是一种非常有希望的肿瘤治疗方向

在本综述中，我们着重于m6A修饰和ncRNA在肿瘤干性中的功能作用，通过一些关键信号途径说明ncRNA和m6A修饰的相互作用，并突出了ncRNA和m6A修饰因子的临床潜力作为反映肿瘤干性和有前景的生物标志物和治疗靶标，以便为寻找肿瘤治疗靶标提供新的见解和途径。

2、m6A修饰与肿瘤干性的关系

肿瘤干性主要影响化疗/放疗耐药、肿瘤发生、转移、肿瘤自我复制能力、肿瘤代谢重编程、肿瘤免疫微环境重塑等。最近的研究表明，m6A修饰在肿瘤干性的各个方面都发挥了重要作用(图2)。

图 2

化疗和放疗的耐药性

目前研究表明，m6A修饰可增强骨肉瘤、结肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)等肿瘤的药物治疗耐药性，导致预后不良。研究还表明，m6A甲基化的改变与肿瘤干性密切相关，可以增加骨肉瘤细胞的获得性化疗耐药。METTL3与获得抗肿瘤药物和放疗的耐药性相关。METTL3通过上调LGR5参与调控结肠癌的干性和化疗敏感性。METTL3通过增加p53 R273H突变蛋白的表达，促进pre-mRNA的优先剪接，促进了结肠癌细胞的耐药。在另一项研究中，METTL3通过招募eIF3b和YTHDF1/3到翻译起始位点来增强YAP mRNA的翻译。下调METTL3表达可提高NSCLC细胞对顺铂的敏感性。以上结果提示，m6A修饰基因是癌基因，m6A修饰是肿瘤药物治疗的不利因素，m6A修饰水平的增加增强了药物治疗的耐药性。然而，降低m6A修饰水平也可增强药物治疗的耐药性。例如，FTO调节宫颈鳞状细胞癌，并通过降低mRNA转录本中的m6A修饰水平和增加切除修复交叉互补组1 (ERCC1)的活性来调节β-catenin的表达，从而在增强化疗耐药方面发挥重要作用。FTO上调和m6A低甲基化通过增强含有m6A修饰的增殖/生存转录本的mRNA稳定性，增加了白血病治疗中TKI的耐受性。

m6A修饰基因也可作为肿瘤发展过程中的抑癌基因。例如，ALKBH5可以通过降低Wnt抑制因子1 (Wnt inhibitory factor 1, WIF-1) mRNA的m6A水平来灭活Wnt信号，从而使胰腺癌细胞对吉西他滨敏感。在目前的研究中，从m6A修饰因子和m6A水平来看，m6A修饰对肿瘤具有双刃剑的作用。m6A修饰基因既可作为癌基因，也可作为抑制基因，且m6A修饰水平的上调和下调均可增强化疗的耐药性。但具体原因尚不明确，值得进一步研究。类似地，m6A修饰也对肿瘤的放疗耐药性有影响。例如，METTL3沉默GSC，通过SOX2依赖的DNA修复来增强对γ射线的敏感性。目前对m6A与放疗耐药的研究还远远不够，因此将m6A修饰与肿瘤发展中的放疗耐药联系起来可能是未来新的研究方向。

肿瘤发生

抑制肿瘤发生：最近的研究表明，m6A修饰可导致肿瘤进展和肿瘤抑制。m6A修饰通过改变mRNA的行为和改变癌蛋白的表达和活性来抑制肿瘤发生。例如，在小鼠大脑移植模型中，下调METTL3或METTL14不仅可以显著促进GSC的生长、自我复制和肿瘤发生，还可以导致GSC引发的肿瘤进展的大幅增加。据报道，ALKBH5通过介导Wnt信号，降低WIF-1 RNA甲基化，从而抑制胰腺癌的发生。

促进肿瘤发生：另一方面，靶位点上的m6A修饰也能促进肿瘤形成，这意味着m6A修饰也成为刺激肿瘤形成的因素之一。例如，ALKBH5通过维持FOXM1的表达来维持GSC的成瘤性。FTO介导PKM2去甲基化从而促进肝癌的发生发展。另一项研究表明，FTO可以促进人类和小鼠的黑色素瘤致瘤性。METTL14对EBV表观转录组重编程与病毒相关的肿瘤发生密切相关。

m6A修饰通过m6A“writers”和“erasers”影响肿瘤发生，这些m6A修饰因子在肿瘤发生中表现出“双刃剑”的作用。实际上，m6A“readers“在肿瘤发生中也发挥了重要作用。例如YTHDF1通过与m6A修饰的eIF3C mRNA结合促进eIF3C的翻译，增加总翻译量，从而促进卵巢癌的发生。如上所示，m6A修饰物(“writer”，“eraser”，“reader”)在肿瘤发生中的确切作用是不同的(包括促进和抑制肿瘤发生)，m6A修饰水平可能值得关注。需要进一步的研究，以找到预防肿瘤进展的新策略和治疗方法。

转移和EMT

转移是导致肿瘤患者死亡的最大原因。它是一种肿瘤细胞运动，涉及到癌细胞通过侵入淋巴管、血管或体腔来适应和定植远处器官。上皮-间充质转化(epithelial -mesenchymal transition, EMT)是上皮和间充质状态之间的过渡，允许细胞具有迁移和侵袭的能力，因胚胎发育中的细胞可塑性与肿瘤进展之间具有显著的相似性，最近被认为是肿瘤转移的关键驱动因素。

m6A修饰基因在肿瘤转移和EMT过程中同时扮演癌基因和抑癌基因的角色。大多数研究表明m6A修饰基因可以作为癌基因促进肿瘤转移。例如，YTHDF1通过m6A-YTHDF1-EGFR轴促进肝癌细胞的转移。骨肉瘤中FTO和METTL14的低表达以及METTL3和YTHDF3的高表达与肿瘤转移相关，可作为预后不良的生物标志物。同样，在肝癌中，YTHDF2调节OCT4 mRNA m6A甲基化，促进肝癌干细胞的转移。此外，METTL3启动的mRNA中m6A修饰通过调节MALAT1-miR-1914-3p-YAP轴，直接促进YAP翻译并增加YAP活性，从而诱导NSCLC耐药和转移。METTL3介导的m6A修饰在胃癌EMT和胃癌转移中起关键作用。经研究，zinc finger MYM-type containing 1 (ZMYM1)是METTL3的m6A修饰靶点，通过招募CtBP/LSD1/CoREST复合物介导抑制E-cadherin启动子活性，促进了GC中EMT的进程和转移。

然而，有研究表明m6A修饰基因也可作为抑癌基因抑制转移。在NSCLC中，ALKBH5通过调节YAP的表达和活性来抑制肿瘤的生长和转移。此外，METTL14介导的m6A修饰SOX4 mRNA抑制结直肠癌的肿瘤转移。如上所述，m6A修饰因子在转移中发挥“双刃剑”作用，其功能的不同可能与不同的靶基因或信号通路有关。

肿瘤自我复制

肿瘤的自我复制能力是肿瘤发生和转移的重要驱动力。最近的研究表明，m6A修饰在肿瘤干细胞的自我复制特征中发挥了重要作用。METTL3表达的减少通过新的METTL3-AFF4-SOX2/MYC信号轴降低ALDH活性和成球能力，从而抑制膀胱癌干细胞的自我复制。有研究报道，下调METTL3或METTL14可以上调CD44的表达，诱导mRNA m6A富集位点的改变，从而改变具有重要生物学功能的ADAM19 mRNA的表达水平，从而促进GSC的生长和自我复制。此外，FTO被证实是一种抑癌因子，可抑制卵巢癌的干性特征。FTO可以阻断cAMP信号，抑制卵巢癌干细胞的自我复制。在卵巢癌细胞中去除FTO增加了m6A修饰，从而诱导卵巢癌细胞球形增殖，并促进了肿瘤干细胞表型。由此可见，m6A修饰在调控肿瘤自我复制过程中通过调节不同信号轴表现出“双刃剑”功能。因此，靶向m6A修饰的肿瘤自我复制相关信号轴可能是一种新的肿瘤治疗途径。

肿瘤代谢重编程

通过重新编程营养获取和代谢途径，肿瘤可以满足生物能、生物合成和氧化还原的需求。代谢重编程活动是肿瘤发展的关键特征。众所周知，肿瘤代谢重编程涉及葡萄糖、脂肪酸和氨基酸代谢。没有一种通用的机制可以被所有类型的癌细胞用来重新编程肿瘤代谢。但有几种常见的糖代谢机制。例如，癌细胞可以调节和劫持糖酵解和葡萄糖摄取的几个步骤，以满足其合成代谢需求。有证据表明，m6A修饰可能与代谢重编程密切相关，这为寻找肿瘤代谢靶点提供了可能。

研究表明MTHFD2参与了单碳代谢，m6A与肾细胞癌患者肿瘤细胞的代谢状态有关，导致预后不良并诱导疾病向晚期进展。MTHFD2通过调节缺氧诱导因子-2 (hypoxia-inducible factor-2α) mRNA的m6A甲基化水平，并通过调节表位的转录环境增强HIF-2α依赖的代谢重编码，这表明m6A甲基化可以以HIF-2α依赖的方式促进有氧糖酵解。本研究表明m6A修饰与糖代谢有一定的联系。然而，关于m6A修饰在肿瘤代谢重编程(如脂肪酸、氨基酸代谢)中的研究非常少，因此在这一领域还需要挖掘更多的调控细节。

肿瘤免疫微环境重构

免疫微环境重构可直接或间接影响肿瘤的发展。其机制主要包括促进肿瘤血管生成，建立合适的肿瘤微环境促进肿瘤进展，调节肿瘤干细胞的功能，筛选适应微环境的肿瘤细胞。大范围看，肿瘤免疫微环境(TIME)包括浸润-排出、浸润-炎症、浸润-三级淋巴组织结构，每种类型都有其独特的特点。近期研究表明，m6A修饰与肿瘤免疫微环境重构密切相关。例如，在GC中，m6A的修饰在TIME多样性和复杂性的形成中起着不可忽视的作用。低m6A修饰可增加突变负担和免疫激活，表现为肿瘤微环境炎症表型，具有良好的生存率。而高m6A修饰与非炎症和免疫排斥的肿瘤微环境表型相关。该表型缺乏有效的免疫浸润，存活率较低。此外，研究表明m6A去甲基化酶ALKBH5的缺失可使肿瘤对免疫治疗敏感。其机制是ALKBH5调节Mct4/Slc16a3的表达，调节肿瘤微环境的乳酸含量，调节肿瘤浸润性Treg细胞和髓系来源抑制细胞的组成。有报道称，ALKBH5、YTHDF1等m6A调控因子与胶质瘤的免疫微环境重构密切相关。此外，研究发现，ALKBH5的缺失减少了CD8+T细胞的浸润，这与m6A修饰与胰腺癌的免疫微环境有关。这些发现为RNA甲基化在肿瘤免疫微环境中的作用提供了新的方向，并证明m6A修饰可能是免疫治疗的潜在靶点。

3、ncRNA与肿瘤干性的关系

随着ncRNA研究的发展，越来越多的证据表明ncRNA与肿瘤生物学行为密切相关。重要的是，许多ncRNA在调节肿瘤干性中发挥了关键作用(图2)。

图 2

miRNA

miRNA调控异常可打破细胞信号传导和生长过程的平衡，为miRNA在肿瘤过程中的作用提供机制。大量研究表明，miRNA与肿瘤干性有关。

促进：在乳腺癌中，过表达miR-204-5p抑制了乳腺癌细胞的增殖和迁移能力。此外，miR-204-5p过表达通过调控PI3K/Akt信号通路改变乳腺癌的代谢特性，抑制乳腺癌的转移。在乳腺癌中，miR-105与代谢重编程相关。当处于足够的营养状态时，miR-105-21重编程肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)的代谢，增强葡萄糖和谷氨酰胺代谢，并为邻近的癌细胞提供能量。当营养不足或代谢副产物积累较多时，这些CAFs可以将乳酸、铵等代谢废物转化为富含能量的代谢物。在乳腺癌中，miR-22促进了侵袭性转移能力，而miR-22也可以沉默抗转移的miR-200，抑制miR-200启动子去甲基化，发挥转移潜能。换句话说，miRNA通过染色质重塑调节乳腺癌的干性发挥拮抗作用。此外，靶向miR-34a-NOTCH1轴可降低乳腺癌的干性和化疗耐药。miR-206/TWF1/MKL1-SRF/IL-11信号通路在乳腺癌的发生和发展中起重要作用。miR-206以MKL1/IL-11通路为靶点，可抑制乳腺癌的干细胞化和转移。

抑制：在膀胱癌中，下调miR-34a导致GOLPH3过表达，而异位表达miR-34a降低了对化疗耐药的膀胱移行细胞癌的干细胞特性。因此，靶向miR-34a-GOLPH3轴可降低膀胱癌干细胞性，特别是在耐药情况下。在结肠癌中，miR-3120-5p在CD133+和LGR5+干细胞中高表达。miR-3120-5p通过靶向Axin2促进结肠癌的干性和侵袭性。在HCC中，大量的研究表明，调控异常的miRNAs参与了HCC的癌变和侵袭性。例如，miR-4319通过靶向FOXQ1抑制细胞增殖，加速细胞凋亡，抑制EMT，防止肿瘤干细胞性。在卵巢癌中，髓系来源的抑制细胞诱导miR-101的表达，从而抑制共抑制基因C-末端结合蛋白-2 (CtBP2)的表达。因此，miR-101与增加转移能力、促进肿瘤发生和肿瘤干性有关。通过在分子水平上揭示肿瘤干性相关的miRNA，它可能为靶向肿瘤干细胞(包括乳腺癌、膀胱癌和HCC中的细胞增殖和迁移、改变代谢状态、化疗耐药和转移)和提高肿瘤治疗的疗效提供了新的途径。

lncRNA

lncRNA在肿瘤中的异常表达可以调节肿瘤的干细胞性，如自我复制、肿瘤代谢重编程和肿瘤进展。例如，在NSCLC中，lncRNA在细胞周期、增殖、免疫反应、转移等方面发挥了重要作用。敲除LINC-ITGB1可以抑制肿瘤干细胞成球，抑制干细胞相关基因的表达，从而降低NSCLC的侵袭和迁移潜能。在结直肠癌中，p53-R273H突变可以通过调控特定的lncRNA如lnc273-31和lnc273-34来增强肿瘤干性和化疗耐药。此外，lncRNA LNMICC可以招募核因子NPM1到脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein, FABP5)，从而重编程脂肪酸代谢，进而促进转移。

目前的证据显示，lncRNA通过形成不同的轴或信号通路来调控肿瘤的干性。例如，LINC-PINT通过miR-425-5p/PTCH1/SHH轴调节喉癌干性。在乳腺癌中，lncRNA FEZF1-AS1通过靶向miR-30a/Nanog轴，促进乳腺癌的干性和肿瘤发生。此外，LINC00511可促进乳腺癌细胞增殖、成球能力，并提高一些干性标志物如OCT4、Nanog、SOX2的表达。此外，LINC00511通过诱导miR-185-3p/E2F1/Nanog轴促进肿瘤生长。lncRNA小核仁RNA宿主基因20 (small nucleolar RNA host gene 20, SNHG20)已被证实是多种肿瘤的致癌基因。抑制SNHG20可以抑制细胞增殖，增加细胞凋亡，破坏干细胞特性，从而防止肿瘤的进展。其中，lncRNA SNHG20通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，促进胶质母细胞瘤的发生和肿瘤干性。此外，lncRNA LUCAT1上调促进乳腺癌干细胞增殖，而下调LUCAT1抑制乳腺癌干细胞的自我复制。进一步研究发现，LUCAT1增加了乳腺癌干细胞的干细胞样特性，lncRNA LUCAT1/miR-5582-3p/TCF7L2轴通过Wnt/β-catenin通路调节乳腺癌干细胞性。因此，聚焦于某些轴或以信号通路为靶点可能会为肿瘤干细胞治疗提供一些新的见解。

circRNA

circRNA在肿瘤中具有巨大的临床前诊断和治疗潜力。据报道称circRNA在增殖、迁移、转移、化疗耐药等方面与肿瘤干性密切相关。众所周知，circRNA在肿瘤中的调控机制是作为miRNA海绵，竞争miRNA上的mRNA结合位点。例如，在乳腺癌中，circRNA_100876通过miRNA海绵方式调节microRNA-361-3p的表达，促进肿瘤转移，增加肿瘤的增殖能力。此外，hsa_circ_0025202作为miR-182-5p的miRNA海绵，通过调节FOXO3a的表达和活性抑制乳腺癌生长。在宫颈癌中，hsa_circRNA_101996作为miR-8075的海绵，miR-8075靶向TPX2，抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭。circSLC8A1作为miR-130b/miR-494的miRNA海绵，调控其靶基因PTEN的表达，从而抑制膀胱癌的进展。除了作为miRNA海绵，最近的研究揭示了circRNA在肿瘤干性调控中的新机制。例如，在HCC中，circZKSCAN1被报道通过调节RBP脆性X智力迟缓蛋白(FMRP)的功能来抑制肿瘤的干细胞性。FMRP的下游靶基因为细胞周期和凋亡调控基因1 (cell cycle And apoptosis regulator 1, CCAR1)。CCAR1可通过Wnt/β-catenin信号通路增强肿瘤干性。然而，抑制circRNA_069718可以降低Wnt/β-catenin通路相关基因如β-catenin、c-myc和cyclin D1的表达水平，从而降低三阴性乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。此外，Hippo-YAP信号通路被circPPP1R12A-73aa激活。该信号通路可促进促进结肠癌的生长和转移。综上所述，这些证据表明circRNA在肿瘤干性调节中发挥了重要作用。然而，circRNA复杂的结构和功能使得人们难以充分了解其在肿瘤干细胞中的作用。因此，需要对circRNA进行更多的机理研究。

4、ncRNA与m6A修饰的相互作用

m6A修饰作为哺乳动物中最丰富的mRNA修饰，与ncRNA的功能密切相关，ncRNA与m6A修饰的相互作用机制如下(图3)。

miRNA和m6A修饰

一方面，m6A修饰通过影响miRNA的生物发生或稳定性参与肿瘤进展调控。机制研究表明，m6A修饰促进miRNA的发生主要是通过m6A与DGCR8的相互作用 (图3a)。

图 3a

例如，在膀胱癌中，METTL3以m6A依赖的方式加速了pri-miR221/222的成熟。pri-miRNA中m6A的修饰使DGCR8能够结合特定底物，并进一步促进miRNA的成熟。此外，miRNA的成熟导致PTEN的减少，从而导致癌细胞增殖和肿瘤生长。此外，在HCC中，METTL14还可以调节miRNA的成熟。在机制上，METTL14通过识别DGCR8并将DGCR8与pri-miRNAs结合来促进pri-miR-126的处理，从而抑制肝癌的转移。据报道，RNA结合蛋白HNRNPA2B1也与pri-miRNA有很强的相互作用。在NSCLC中，HNRNPA2B1与pri-miRNA转录本中的m6A修饰位点结合，从而与miRNA微处理元件复杂蛋白DGCR8相互作用，进而促进pri-miR-106b加工。在胶质母细胞瘤中，HNRNPC，一个m6A“reader”，与pri-miR-21结合，促进miR-21的成熟。HNRNPC沉默可降低miR-21表达，抑制AKT-p70S6K通路，抑制肿瘤侵袭。m6A修饰调控miRNA生物发生的另一个机制是增加pre-miRNA的Dicer剪接。例如，在NSCLC中，METTL3通过miR-143-3p/VASH1轴调节pri-miR-143-3p的Dicer切割，并在肿瘤转移中发挥重要作用。此外，m6A“eraser”也参与了miRNA的处理。m6A“eraser”与miRNA表达水平存在一定的正相关。例如，敲除FTO可以上调m6A的修饰水平，进而导致一些成熟miRNA如miR-7-5p和miR-22-3p的下调。具体的调控机制值得进一步研究(表1)。

表1

另一方面，miRNA可以调控靶转录本上m6A的丰度。例如，miRNA可以通过调节METTL3与含有miRNA靶向位点的mRNA的结合来调节m6A的修饰水平。此外，miRNA可以调控m6A修饰因子的表达水平，从而显著影响m6A修饰的整个过程。例如，在NSCLC中，miR-33a通过靶向METTL3的mRNA抑制其表达，抑制细胞增殖。此外，有报道称miR-600可以通过逆转METTL3的生物学功能来抑制METTL3的表达，阻止NSCLC的进展。在乳腺癌中，乙肝X-相互作用蛋白(HBXIP)通过抑制let-7g上调METTL3。METTL3可以增加HBXIP的表达，从而形成HBXIP/let-7g/METTL3/HBXIP的正反馈回路，加速癌细胞增殖。另外，miR-145通过靶向YTHDF2 mRNA的3'-UTR抑制YTHDF2的表达，抑制肝癌细胞增殖。在结直肠癌中，miRNA-1266的低表达水平通过直接靶向FTO促进肿瘤的发生和进展，因此将m6A修饰和miRNA在肿瘤发展中的调控联系在一起 (表2)。

表 2

综上所述，一方面，m6A修饰通过以下几方面影响miRNA的生物发生和稳定性：(1)m6A与DGCR8的相互作用，(2)m6A与RNA结合蛋白HNRNPA2B1的相互作用，(3)增加pre-miRNA的Dicer剪接。另一方面，miRNA可以调控靶转录本上m6A的丰度，miRNA可以通过靶向m6A修饰因子的3’UTR调控m6A修饰因子的表达水平。

lncRNA和m6A修饰

据报道，在lncRNA中m6A修饰也很常见。lncRNA与m6A修饰之间的相互作用已被广泛研究。例如，m6A开关在这种相互作用中发挥了重要作用(图3b)。m6A修饰通过改变RNA结构来影响在生物学过程中lncRNA-蛋白的相互作用。m6A可以改变mRNA和lncRNA的局部结构，促进其与HNRNPC的结合，因此m6A修饰负责pre-mRNA的加工。METTL3和METTL14增强lncRNA MALAT1和HNRNPC的结合，促进基因表达。

图3b

此外，m6A参与了lncRNA介导的ceRNA模型(图3c)。特别是研究发现METTL3/YTHDF3复合物可以提高MALAT1的稳定性，并通过MALAT1-mir-1914-3p轴促进YAP mRNA的翻译。MALAT1作为ceRNA，通过吸纳miR-1914-3p来促进NSCLC的侵袭和转移。此外，m6A修饰参与了lncRNA-miRNA相互作用。据报道，m6A修饰的LINC1281介导ceRNA模型调节小鼠胚胎干细胞分化。有趣的是，下调METTL3可以取消let-7与LINC1281的结合，因此这种RNA-RNA相互作用与m6A修饰有关。然而，这种相互作用的潜在机制尚需进一步研究。

图 3c

此外，METTL3的敲除可削弱XIST介导的基因沉默，这是lncRNA中m6A修饰的另一种调控模式 (图3d)(表1)。

图 3d

同时，lncRNA还可以调控m6A修饰分子的表达和功能。在宫颈癌中，lncRNA GAS5-AS1被证明通过促进ALKBH5依赖的m6A去甲基化来提高GAS5的稳定性。在肝癌中，lncRNA GATA3-AS引导KIAA1429介导的m6A修饰，从而促进肿瘤的生长和转移。此外，在GC中，lncRNA LINC00470促进了METTL3介导的m6A甲基化，从而抑制PTEN的表达，从而促进了GC的发展 (表2)。

m6A修饰与lncRNA之间的相互作用涉及两个方面。m6A修饰影响RNA-蛋白相互作用，参与lncRNA介导的ceRNA模型，并参与lncRNA-miRNA相互作用。此外，lncRNA还可以通过调节m6A修饰因子来调控m6A修饰的表达和功能。

circRNA和m6A修饰

m6A修饰也是环状RNA中常见的现象。尽管circRNAs和mRNAs共用相同的“writers”和“readers”m6A修饰, m6A修饰circRNAs通常来源于没有甲基化的mRNA外显子,而甲基化的mRNA在同一外显子则有m6A修饰,当被“reader” YTHDF2识别时circRNAs变得不稳定。越来越多的证据表明，m6A修饰可以影响环状RNA的许多生物学功能，如促进环状RNA的细胞质输出、驱动翻译、介导降解等。例如，circNSUN2的m6A修饰可调节其胞质输出(图3e)。其机制是YTHDC1识别了这个circNSUN2，在细胞质中形成了一个circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2 RNA -蛋白三联体复合体。此外，m6A修饰的circNSUN2可增强HMGA2 mRNA的稳定性，从而促进CRC的转移和进展。此外，m6A修饰可以通过内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry sites, IRESs)促进一些环状RNA的cap-不依赖蛋白翻译。这种m6A驱动的翻译需要起始因子eIF4G2和m6A“reader”YTHDF3，这极大地增加了对人类转录组的认识(图3f)。最近YTHDF2发现了一个由m6A修饰的circRNAs亚群，并且通过HRSP12-RNase P/MRP核糖核酸内切酶复合物选择性下调了circRNAs的水平，这可能是m6A修饰介导的circRNAs降解的一种新的机制 (图3g)(表1)。

图 3 e-g

如上所示，m6A修饰会影响circRNA的功能。这些功能包括促进细胞质输出、驱动翻译和介导降解。然而，circRNA对m6A修饰的影响尚未见报道，这可能是未来的一个新的研究方向。

5、m6A修饰的ncRNA与肿瘤干性的关系

如上所述，我们总结了m6A修饰、ncRNA与肿瘤干性之间的关系。然而，m6A修饰的ncRNA与肿瘤干性之间是否存在联系尚不清楚。所以，在这一部分，我们说明了m6A修饰的ncRNA与肿瘤干性的关系。

miRNA中的m6A修饰在肿瘤干性中起着关键作用。在膀胱癌中，METTL3促进了miR-221/222的成熟，并加速了癌细胞的增殖、生长和干细胞性。在结直肠癌中，METTL3促进miR-1246成熟，下调抑制基因SPRED2。SPRED2是miR-1246的下游靶点，下调SPRED2可以逆转对MAPK通路的抑制，从而促进肿瘤转移和干细胞化。也有一些证据表明，lncRNA和circRNA中的m6A修饰与肿瘤干性有很强的联系。例如，在鼻咽癌中，lncRNA FAM225A可以吸纳miR-590-3p/miR-1275发挥其生物学功能。m6A修饰通过激活FAK/PI3K/AKT信号通路，使促癌的lncRNA FAM225A更加稳定，从而促进肿瘤发生、转移和干性。在CRC中，m6A修饰加速了circNSUN2向细胞质输出，细胞质中circNSUN2的上调增强了肿瘤的侵袭性和干性。其具体机制是circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2复合物能够稳定HMGA2，而HMGA2 mRNA与CRC细胞的侵袭密切相关。在HCC中，m6A修饰的circRNA-SORE通过调节Wnt/β-catenin信号通路维持对索拉非尼耐药。circRNA-SORE作为miRNA海绵，隔离miR-103a-2-5p和miR-660-3p，从而竞争性地激活Wnt/β-catenin通路，诱导索拉非尼耐药和干性。综上所述，显然m6A修饰的ncRNA在肿瘤干性的调节中发挥了重要作用，这种调节的潜在机制和临床意义值得进一步研究。

6、ncRNA和m6A修饰调控肿瘤干细胞的关键信号通路

METTL3可以甲基化pri-miR-1246以促进其成熟。METTL3/miR-1246/SPRED2轴通过调控MAPK信号通路在CRC转移中发挥重要作用[。METTL14通过miR-375/ Yes相关蛋白1 (YAP1)通路和miR-375/SP1通路抑制CRC细胞生长、迁移和侵袭。miR-186是METTL3的直接靶点，通过Wnt/β-catenin信号通路，METTL3/miR-186可促进肝母细胞瘤的进展。如上所示，有证据表明m6A修饰的ncRNA在肿瘤干性调节中发挥了重要作用，但此类研究数量有限。为了了解ncRNA和m6A修饰调控的肿瘤干细胞的关键信号通路，这些通路中的一些关键分子可能提供新的见解和途径。

大量研究表明，一些关键信号通路通过ncRNA与m6A修饰这些通路关键分子的相互作用，参与调控肿瘤干性 (图4)。

图 4

Wnt/β-catenin

Wnt信号是大多数类型肿瘤干细胞性的关键驱动因素。核心的Wnt/β-catenin信号通路可以控制干细胞，参与CRC、HCC、胰腺癌等肿瘤的发生。此外，ncRNA被证实在该信号通路中发挥了重要作用。例如，miR-1246可以通过抑制AXIN2和糖原合成酶激酶3β (GSK3β)的表达来激活Wnt/β-catenin通路。lncRNA NEAT1通过DDX5激活Wnt/β-catenin信号通路，实现其致癌功能，促进CRC进展和转移。LINC00210通过与CTNNBIP1相互作用，阻断CTNNBIP1与β-catenin结合，激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进肝癌的自我复制和增殖。抑制circRNA_069718可以降低Wnt/β-catenin通路中的β-catenin的表达水平。此外，该信号通路中的一些关键分子如GSK3β与m6A修饰有关。例如，FTO在GSK3β缺乏的mESCs中升高。在Wnt/β-catenin通路中，FTO可被GSK3β磷酸化。然而，在GSK3β敲除mESCs中，这一过程被破坏，导致FTO蛋白上调。这一结果可能为m6A修饰与信号通路之间的相互作用提供了新的见解。

MAPK

MAPK信号通路也与肿瘤干性密切相关。多种ncRNA参与了这一信号通路的调控。miRNA-21表达上调可抑制CVB3感染的Hela细胞中MAPK信号通路。miR-497抑制MAPK/ERK信号通路的表达，促进骨肉瘤细胞凋亡。据报道，lncRNA DRHC通过调节MAPK信号通路中的MEK/ERK活性来抑制肝癌的成瘤性。miR-125a-3p破坏p38/MAPK通路并表现出抑瘤功能。此外，circ-MAPK4可作为miR-125a 3p的海绵，通过调节p38/MAPK通路影响胶质瘤的增殖和凋亡。在乳腺癌中，circ_0006528可以通过促进MAPK/ERK通路中Raf1的表达来促进肿瘤的生长和迁移。MEK1/2和ERK1/2是MAPK信号通路中两个必不可少的分子。据报道，m6A修饰对这些分子有重要影响。例如，YTHDF2在HCC细胞中过表达激活MEK和ERK，抑制癌细胞增殖。其机制是YTHDF2作为肿瘤抑制因子，结合EGFR 3’-UTR的m6A修饰位点，从而促进EGFR mRNA的降解。METTL3的缺失可以增加MAPK信号通路中ERK的磷酸化水平，影响该通路的整体活性和功能。

Hippo

Hippo通路在肿瘤干性中的作用已经被研究过。GC中，miR-375通过靶向YAP1-TEAD4-CTGF轴调控Hippo通路。进一步研究表明，过表达YAP1可降低miR-375的抑瘤作用，促进胃癌进展。此外，有报道称lncRNA UCA1通过Hippo通路促进胰腺癌细胞迁移和侵袭。过表达UCA1可以抑制Hippo通路中YAP的磷酸化，增加YAP的表达水平。同样，在GC细胞中，LINC00662通过Hippo通路调控GC细胞的增殖。敲除LINC00662可以通过海绵作用miR-497-5p抑制Hippo-Yap信号通路。另一项研究表明，circPPP1R12A-73aa可以激活Hippo-YAP信号通路，从而促进结肠癌转移同时，m6A修饰也参与了Hippo信号转导中关键分子YAP的调控。YTHDF3是YAP的新靶点，可以促进m6A修饰的lncRNA GAS5的降解，从而揭示lncRNA GAS5-YAP-YTHDF3轴的负向功能调节环路，并发现m6A诱导GAS5在结直肠癌进展过程中对YAP信号的衰减的新机制。

JAK/STAT3

JAK/STAT3信号通路是肿瘤干性研究领域中最有前途的信号通路之一，它是ncRNA与m6A肿瘤发生和转移之间的桥梁。在NSCLC中，miR-30e-5p通过抑制USP22介导的Sirt1/JAK/STAT3信号通路抑制肿瘤发生和转移。进一步研究发现，miR-30e-5p可以抑制Sirt1表达，增加磷酸化的STAT3表达，从而激活STAT3活性。此外，在CRC中，lncRNA ITIH4-AS1的上调导致RE1沉默转录因子(REST)的下调或耗尽。REST下调进一步增强了ITIH4-AS1的表达，并通过JAK/STAT3途径促进肿瘤的增殖和转移[140]。此外，有报道称circDOCK1可促进JAK/STAT3信号通路中JAK1和STAT3的磷酸化，并通过抑制miR-124加速甲状腺癌的发生。近年来，有证据表明m6A修饰可调控JAK/STAT3信号通路中的关键分子。例如，METTL3的缺失会干扰JAK2和SOCS3的表达，损害自我复制能力，并引发诱导多能干细胞的分化。

综上所述，肿瘤干性可以通过一些关键的信号通路进行调控，而这些信号通路中必不可少的分子可能与m6A的修饰和ncRNA的调节有关。以上证据为m6A修饰与ncRNA在肿瘤干性，特别是在肿瘤侵袭、转移、肿瘤发生和自我复制等方面提供了新的思路。也就是说，m6A修饰与肿瘤干性相关信号通路中的一些关键分子发生调控或相互作用，这些信号通路也可能受到ncRNA的影响，ncRNA将m6A修饰、ncRNA和肿瘤干性联系在一起。然而，m6A修饰与信号通路中的关键分子之间的相互作用尚未深入研究，其具体调控机制还有待进一步研究。

7、ncRNA和m6A修饰物作为预示肿瘤干细胞性的生物标志的临床潜力

发现晚是导致肿瘤患者生存和预后差的主要原因。高特异性和敏感性的生物标志物可能是开发非侵入性肿瘤早期诊断标志的新方向。如今，ncRNA和m6A修饰因子有望作为预示肿瘤干性和肿瘤进展的生物标志物(图5)。例如，外泌体miRNAs可以作为早期和微创肿瘤诊断的新的生物标志物，因为外泌体通常是可以稳定存在于体液中，如血液、唾液、尿液、乳胶和脑脊液。最近，循环miRNA谱被认为有望用作肿瘤液体活检筛查中的工具，而7-miRNA组(7-miRNA组:miR-6087, miR-6724-5p, miR-3960, miR-1343-5p, miR-1185-1-3p,miR-6831-5p和miR-4695-5p)被报道作为膀胱癌早期检测的非侵入性生物标志物。此外，检测血浆中miRNA生物标志物对HCC的筛查具有潜在的诊断价值。研究表明，外周血浆miR-148a被认为是预测HCC发生和进展的可能的生物标志物。此外,异常的lncRNAs水平也可能确定肿瘤细胞的侵袭性和转移性能力。lncRNA SNHG12是一个可靠的生物标志物,因为它在多种肿瘤中的高稳定性和大量表达，而被认为具有临床应用价值，包括胃癌,非小细胞肺癌,膀胱癌等。一些外泌体来源的lncRNAs参与了肿瘤干细胞性方面的调节，如化疗耐药性。此外，来自肿瘤的外泌体lncRNAs是非侵入性诊断的可靠的候选对象。例如，血清外泌体lnc-GNAQ-6:1可能被用作胃癌的一种新的诊断标志物。更有趣的是，循环lncRNA XLOC_009167在不同条件下在全血中都是稳定的，因此lncRNA XLOC_009167在NSCLC的诊断中可能比传统的生物标志物具有更好的诊断潜力。此外，circRNA_0001178和circRNA_0000826在有和无肝转移的CRC患者中的表达存在差异，表明这两种circRNA可能作为不同的CRC肝转移的诊断生物标志物。还有报道称在胃癌患者血浆外泌体中检测到circ-KIAA1244，血浆circ-KIAA1244的低表达可抑制淋巴转移，提高总生存率，提示circ-KIAA1244可能作为一种新的检测胃癌转移的循环生物标志物。另外，circ_0068669的表达与微血管浸润和TNM分期相关，这表明circ_0068669可能是预测HCC转移的一个很可靠的生物标志物。在NSCLC中，一些证据表明血浆circFARSA可以作为肿瘤侵袭和转移的一种潜在的非侵入性生物标志物。

图 5

同样，m6A修饰因子也被报道作为肿瘤干性的生物标记物，因为它们在肿瘤起始、转移和复发过程中，在调节基因表达方面发挥了重要的调控作用。其中，下调METTL14的表达可以促进肿瘤转移，METTL14被证实是一种潜在的预示CRC转移的预后生物标志物。此外，METTL14还作为结直肠癌的有效治疗靶点，影响SOX4介导的EMT过程和PI3K/AKT信号抑制结直肠癌进展。此外，METTL3被报道与不良预后和生存相关。过表达METTL3可促进胃癌细胞增殖、血管生成、糖酵解过程和肝转移。此外，FTO和ALKBH1等m6A“erasers”的异常表达在胃癌患者中具有不同的预后价值，这两种“erasers”可能作为胃癌进展和转移的潜在生物标志物。此外，m6A“readers”如YTHDF1和HNRNPC也在肿瘤干性方面作为有前途的生物标志物。在HCC中，YTHDF1被报道在调节细胞周期进展和肿瘤代谢重编程中发挥重要作用，提示YTHDF1可能是提示HCC预后的潜在生物标志物。此外，HNRNPC参与膀胱癌的转移和侵袭等恶性行为，且HNRNPC的表达与膀胱癌患者的不同临床病理变量显著相关，这表明HNRNPC可能是很有希望的生物标志物。目前，外周血m6A修饰因子似乎是一种潜在的检测和诊断NSCLC的非侵入性生物标志物，NSCLC中FTO和ALKBH5的下调与肿瘤的分期和转移有很大关系。

现在一些m6A抑制剂也在被研究，通过靶向m6A调节因子，为肿瘤提供了新的治疗方法。大多数抑制剂以m6A“erasers”为目标。例如，MO-I-500是一种FTO抑制剂，可以抑制乳腺癌细胞的存活和集落形成。R-2HG是突变IDH1/2的代谢产物，被定义为FTO的抑制剂，可以抑制白血病的进展。FB23-2 (FTO抑制剂)抑制AML细胞增殖，促进细胞凋亡。FTO-04通过抑制FTO增加了胶质母细胞瘤干细胞中m6A修饰水平。此外，还有其他FTO抑制剂，如甲氯灭酸(MA)被用于肿瘤治疗。另外还开发有ALKBH5抑制剂。例如，MV1035是一种ALKBH5抑制剂，它显著降低了胶质母细胞瘤的迁移和侵袭性。m6A抑制剂在各种肿瘤中显示出重要的功能，因为它们可以通过抑制m6A修饰因子参与肿瘤的发展。然而，m6A抑制剂的“writers”和“readers”目前尚未见报道，这将是未来的一个新的研究方向。

8、结论和局限性

综上所述，m6A修饰(包括“writer”、“reader”、“eraser”)和ncRNA (miRNA、lncRNA、circRNA)与肿瘤干性(化疗耐药、放射耐药、肿瘤发生、转移、肿瘤自我复制能力、肿瘤代谢重编程、肿瘤免疫微环境重构)密切相关。而m6A修饰、ncRNA与肿瘤干性之间的相互作用十分复杂。m6A修饰基因既可作为癌基因，也可作为抑癌基因，ncRNA可在多种肿瘤中发挥不同的功能。此外，m6A修饰水平的升高和降低可能都是促癌因素，具体机制尚不明确，可能与不同的靶点或信号通路有关。我们阐明了ncRNA和m6A修饰在肿瘤干性调节中的相互作用，并证明了一些关键信号通路可能在这种相互作用中起桥梁作用。此外，m6A修饰因子和ncRNA有希望作为预示肿瘤干性的生物标志物，因为它们可以为肿瘤的早期和非侵入性检测提供一种方法，并为发现肿瘤诊断、治疗和预后有用的靶点提供新的思路。此外，一些m6A抑制剂可能成为肿瘤干性的新治疗靶点。然而，目前还没有有力的证据表明ncRNAs是否可能成为潜在的治疗靶点，值得进一步研究。更重要的是，虽然一些研究表明ncRNA可能成为肿瘤诊断的潜在生物标志物，但完成临床试验的却很少，这意味着验证其临床价值还有很长的路要走。

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