案例解析：草莓m6A修饰调控ABA通路介导果实成熟机制 | m6A专题

论文标题：N6-methyladenosine RNA modification regulates strawberry fruit ripening in an ABA-dependent manner

刊登日期：2021年05月

发表杂志：Genome Biology

影响因子：10.806

研究机构：中科院植物研究所秦国政课题组

文献地址：https://doi.org/10.1186/s13059-021-02385-0

前言

果实中富含的营养成分是人类膳食结构的重要组成部分，对人体健康不可或缺。果实品质在成熟过程中逐渐形成，受到精确调控。解析果实成熟调控机制，将为果实品质改良和新品种选育提供理论基础。

根据成熟机制的不同，果实可分为两种类型：呼吸跃变型（如番茄、苹果、香蕉）和非呼吸跃变型（如草莓、葡萄、柑橘）。植物激素乙烯（ethylene）在呼吸跃变型果实的成熟调控中发挥关键作用，而脱落酸（abscisic acid, ABA）则参与非呼吸跃变型果实成熟调控。

已有研究表明，DNA甲基化在呼吸跃变型果实和非呼吸跃变型果实的成熟调控中均发挥重要作用。与DNA甲基化相对应，RNA甲基化（m6A）是mRNA上含量最丰富的修饰，对于动植物的多个生物学过程至关重要。

此前，中科院植物所秦国政研究组已经发现，m6A修饰参与呼吸跃变型果实番茄的成熟调控（DNA甲基化调控m6A甲基化影响番茄果实成熟 | m6A专题）。然而，m6A在非呼吸跃变型果实成熟调控中的功能仍不清楚。在不同类型的果实中，m6A的调控机制是否存在进化保守性有待研究。

近日，秦国政研究组在Genome Biology发表了题为N6-methyladenosine RNA modification regulates strawberry fruit ripening in an ABA-dependent manner的研究论文，揭示了RNA甲基化修饰调控草莓果实成熟的作用机制。

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1. 草莓果实中mRNA普遍存在大量m6A修饰

作者先对二倍体草莓（Fragaria vesca）的几个发育关键阶段和时间点进行了m6A测序，每个时间点必须有3个生物学重复（联川生物温馨提示，现在高分文章还是需要有至少3个生物学重复的）。这几个关键的发育时间点包括即S6（生长阶段6）、RS1（成熟期1，21 DPA）和RS3（成熟期3，27 DPA）。

作者分别在S6、RS1和RS3的果实中鉴定了8934、8990和8374个基因转录本，这些转录本上总计含有9778、10853和10095个的m6A峰。

这些数据都经过m6A-IP-qPCR验证万字长文教你做（m6A-IP-qPCR至尊豪华版 | m6A专题），作者随机选择了3个含有m6A修饰和3个不含有m6A修饰的基因进行了验证发现与测序数据均吻合。

作者基于转录组测序的水平，估计草莓的转录组中每个活跃表达的转录本含有0.6-0.7个m6A峰，这与在拟南芥或番茄中观察到的水平相当（DNA甲基化调控m6A甲基化影响番茄果实成熟 | m6A专题），表明草莓果实mRNA的也含有大量m6A修饰。大多数转录本（> 86%）有一个m6A peak。有趣的是，当草莓果实成熟时，含有两个或更多m6A peak的转录物的百分比显著增加，从S6的2.95%变化到RS1的13.07%，RS3的13.63%。

2. 草莓果实成熟的起始阶段的m6A分布发生显著变化

三个样本m6A的整体peak都在终止密码子周围和3′UTR内高度富集，但这些区域中m6A峰的比例在成熟过程中显著下降（用绿色箭头表示）。与S6处相比，m6A峰的比例显著增加（用红色箭头表示），这个结果与番茄的有所不同。

位于CDS区域的m6A峰的百分比从S6到RS1从5.18%增加到23.26%，但是从RS1到RS3没有显示出明显的变化。相比之下，从S6到RS1，m6A峰落入终止密码子区和3′UTR的百分比分别从39.95%和53.81%下降到34.22%和38.99%，从RS1到RS3没有观察到明显的变化。

因此m6A在成熟的起始阶段表现出显著的变化，而不是在成熟开始后。Motif分析表明，草莓中含有动植物中均非常保守的RRACH，但是没有出现植物特有的URUAY，这表明物种之间复杂的m6A修饰现象。

3. m6A对草莓果实成熟过程中mRNA丰度的影响

值得注意的是，作者使用LC-MS/MS对整体m6A水平进行检测后并未发现三个阶段整体m6A水平有显著变化。作者推测一些高甲基化和低甲基化的基因存在动态平衡，导致样本之间整体水平差异不大，被相互抵消了。这就表明即便是整体m6A水平差异不大，也是往下继续测序的，我们需要锚定到具体感兴趣的基因！

成熟果实一些特异性m6A峰大多与植物发育相关，包括对激素刺激的反应、发育过程、组蛋白修饰、小分子生物合成过程和蛋白质运输。相反除了发育途径外，具有非差异m6A峰的基因在多种生物过程中富集。这些结果表明，m6A基因修饰的动态变化是这些基因在果实发育和成熟过程中发挥功能的主要原因。

值得注意的是，数百个催熟诱导和催熟抑制基因，其在RS1中的表达显著高于或低于S6，表现出差异m6A修饰。通过GO富集分析发现这些基因在组织发育、核质转运等过程中富集，暗示m6A甲基化参与草莓果实成熟的调控。

4. ABA相关基因在草莓成熟初期m6A水平有显著差异

在m6A测序结果中，发现ABA信号通路相关的一些基因如NCED5、ABAR（ABA受体）、AREB1（ABA反应元件结合蛋白A）等在CDS区m6A水平显著上调。这三个基因都被认为可以调控草莓果实的成熟。NCED5编码ABA生物合成的限速酶，而ABAR和AREB1分别编码ABA受体和ABA反应元件。这些结果通过m6A-IP-qPCR以及mRNA半衰期实验+A碱基点突变实验等多种方法得到验证。

作者继而研究CDS区域的m6A修饰发现，这3个基因中的ABAR翻译效率与m6A修饰呈正相关。点突变实验证实这个基因翻译效率下降。

总之，这些数据表明ABA途径中的关键基因经历m6A介导的转录后调控，从而促进mRNA的稳定性或促进翻译。

5. 草莓果实m6A甲基转移酶的特性研究

系统进化分析表明，拟南芥的MTA和MTB是哺乳动物METTL3和METTL14的同源蛋白。同理，草莓中MTA和MTB不仅与拟南芥同源性很强，关键催化区域在进化上也和哺乳动物的METTL3和METTL14高度一致。草莓中的MTA和MTB均含有高度保守的MT-A70结构域，该结构域显示出与在哺乳动物和拟南芥中观察到的蛋白序列极其相似的蛋白序列

转录组分析表明，MTA和MTB在成熟的起始阶段（从S6到RS1）显著增加。八倍体栽培草莓中MTA和MTB的同源基因也表现出从白色（Wt）期到初始红色（IR）期的表达增加，表明MTA和MTB可能在调节草莓果实成熟中起重要作用。

如同哺乳动物中的METTL3和METTL14互作一样，为了探索草莓中的MTA和MTB以异二聚体形式发挥作用的可能性，作者使用酵母双杂交系统分析了MTA和MTB之间的相互作用。当MTA-mCherry与MTB-eGFP共表达时，这两种蛋白倾向于在细胞核内共定位。

6. m6A甲基转移酶MTA正调控草莓果实成熟

有大量植物m6A研究证实MTA、MTB等基因为植物的m6A甲基化转移酶。作者对MTA和MTB在八倍体草莓中进行RNAi干扰和过表达实验后发现，MTA和MTB抑制或延缓了果实成熟。LC-MS/MS也证实RNAi后整体m6A水平下降。

MTA的RIP实验证实，NCED5、ABAR和AREB1能够直接被MTA binding。与对照组相比，MTA RNAi后果实中NCED5、ABAR和AREB1的 m6A修饰水平和mRNA表达显著降低，而过表达MTA组结果则相反。

相比之下，MTA过度表达或RNAi，能够增强或降低ABAR mRNA的翻译效率，但对NCED5和AREB1的翻译效率没有显著影响。

总之，这些结果表明MTA可能通过靶向ABA途径中的基因来调控草莓果实的成熟，从而提高这些基因的mRNA稳定性或翻译效率。

7. MTA是草莓mRNA整体m6A修饰的关键酶

作者对MTA-RNAi和对照的草莓果实进行了m6A-seq。在MTA-RNAi果实和对照组中，分别在7933和5180个基因转录物内鉴定出8693和8704个m6A peak，并发现了保守的RRACH motif。

与对照组相比，作者在MTA-RNAi果实中鉴定出2520个低甲基化m6A峰，覆盖1128个基因转录本，在1239个基因转录本中鉴定出1510个高甲基化m6A峰，表明MTA沉默时m6A整体水平降低。低甲基化m6A峰主要分布在CDS区（76.19%），而高甲基化m6A峰高度富集在终止密码子附近（31.26%）或3′UTR内（61.46%）。这个结果与前面的果实成熟期间确定的差异m6A峰的分布非常相似。

转录组分析表明，共有4488个下调基因和4754个上调基因。转录组和m6A测序联合分析表明，在MTA RNAi果实中含有低甲基化m6A修饰的基因mRNA更可能下调，表明MTA介导的m6A甲基化与mRNA表达呈正相关。GO分析显示，低甲基化m6A修饰的基因对生物过程有显著的注释，包括对激素刺激的反应、发育过程、多细胞组织发育、细胞壁组织和次级代谢过程，这是果实发育和成熟的先决条件。重要的是，作者发现许多与成熟相关的基因，包括那些参与花青素生物合成、糖代谢、细胞壁组织和降解以及激素信号传导的基因，在MTA-RNAi果实中显示出低甲基化。

总之，这些结果表明MTA是草莓果实成熟过程中介导整体mRNA上m6A甲基化必要条件，它通过靶向不同生物过程中的成熟相关基因来保证草莓果实成熟的生理过程得以正常进行。

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