干货收藏-植物m6A论文大致内容和框架简介 | m6A专题

前言部分：第一段通常要对m6A做一个整体的介绍，而m6A的大量原创工作还是集中在人、小鼠等模式动物中。对于常规的甲基化转移酶（Writers）如METTL3、METTL14、WTAP、HAKAI、RMB15、KIAA1429等，去甲基化酶（Erasers）如FTO和ALKBH5，以及阅读蛋白（Readers）YTH家族、eIF3、IGF2BP1、HNRNPA2B1等进行一个总结。引用的参考文献可以参考RNA甲基化领域的大牛杨运桂教授2018年发表在Cell Research上的综述Dynamic transcriptomic m6A decoration: writers, erasers, readers and functions in RNA metabolism，以及何川教授2019年发表在Molecular Cell上的综述Where, When, and How_ Context-Dependent Functions of RNA Methylation Writers, Readers, and Erasers。当然植物学领域也在2019年有了第一篇非常系统的m6A综述。西北农林科技大学的宋卫宁教授在2019年的Plant Biotechnology Journal发表了题为N6-methyladenosine regulatory machinery in plants_ composition, function and evolution的文章，也可以放在第一段作为参考（综述-植物m6A甲基化酶功能进化及调控机制 | m6A专题）。第二段可以对植物领域m6A研究的一些状况做一些总结和展示，一般2017年及2018年Plant Cell上发表了大量关于拟南芥m6A的文章。首先可以罗列拟南芥的一些甲基化酶如MTA、MTB（HAKAI同源蛋白）、FIP37、ALKBH10（At4g02940）、ECT家族等研究进展。其他可以适当做一些延伸。除了Plant Journal、Plant Physiology、Plant Cell、New Phytologist外，植物m6A文献少量分布在Genome Biology和Developmental Cell等杂志内。整体来说植物m6A发文量基本不大，建议参考北京大学贾桂芳课题组出品的论文。我们在本文最末尾会附上值得模仿的参考文献列表。第三段，通常既可以介绍自己研究课题的一些进展，也可以直接引申出正文实验的研究内容以及想要解决的问题。非实验部分需要做的工作1. 非模式植物甲基化酶同源蛋白寻找（Phylogeny analysis of MTA/MTB/FIP37/ALKBH10/ECT family）通常除了拟南芥之外，只有少量的植物有m6A的相关研究发表如番茄、水稻以及玉米。所以在这些文章中我们发现，作者大部分首先要在本物种内寻找甲基化酶同源蛋白。这样做的目的很明显，这个物种在m6A方面没有报道或者很少报道，那么老师的第一个任务就是要告诉审稿人，在我这个没有报道的物种里，这些蛋白是甲基化酶。对于已经有基因组报道的物种，老师可以登录NCBI或者Ensembl plant网站找到同源蛋白。具体方法请参考 非模式生物如何寻找m6A甲基化酶同源基因？|m6A专题？。对于自己已经测了基因组，但是没有公布公开的课题组来说，可以使用本地blast模式或者让具有专业生信服务资质的团队提供该服务。通常这里分为两步，第一步找到m6A甲基化酶的同源蛋白序列和mRNA序列。第二步就是这些甲基化酶的整个家族也要进行分析。这样做的目的是，正式敲定植物体内的m6A甲基化酶，而整个家族蛋白都进行分析，是为了排除其他的甲基化酶的影响。例如在拟南芥中ALKBH1和ALKBH3可以对m1A等碱基修饰有去甲基化催化作用，而ALKBH10（也叫At4g02940）则只对发生m6A的修饰有去甲基化的催化作用。所以这部分工作还是有必要的。下面我们会将几篇植物高分论文中的内容进行展示，让老师有更直观的感受案例1.1：Arribas-Hernã, et al. An m6A-YTH Module Controls Developmental Timing and Morphogenesis in Arabidopsis. Plant Cell (2018) 30(5):952 （案例解析：m6A-YTH组件调控拟南芥叶片发育时间和形态发生 | m6A专题）                                             这篇论文中，作者研究的是拟南芥的reader，即ECT家族。所以我们可以从上图看到，作者先罗列了ECT家族的情况，一共列出了11个家族蛋白，而用于进化分析的序列包括人YTH家族等。案例1.2：Scutenaire, J, et al. The YTH Domain Protein ECT2 is an m6A Reader Required for Normal Trichome Branching in Arabidopsis. Plant Cell 30.5(2018):986这篇论文中作者对真菌、植物、动物将近60个reader即YTH家族进行进化分析，找到了拟南芥ECT家族的同源蛋白。案例1.3：Miao, Z., et al. Evolution of the RNA N6-methyladenosine methylome mediated by genomic duplication. Plant Physiology (2019): pp.00323 （客户文章 | Plant Physiology玉米m6A进化由基因组重复事件介导）在这篇文章中，马闯课题组将拟南芥、水稻、人、酵母中的writers、erasers、readers与玉米中的基因进行了进化分析后发现，玉米中MTA、MTB、HAKAI家族、FIP37家族、ALKBH9以及ECT家族都与拟南芥水稻等物种在进化上高度保守。2. 甲基化酶蛋白3D同源建模及催化结构域分析鉴于蛋白在三级结构上非常保守，其中无论是动物、植物还是真菌，m6A甲基化酶一些催化的核心结构域domain在功能上是基本相似的。通过软件或在线预测网站对本物种鉴定出来的甲基化酶进行二级结构预测和三级结构同源建模，鉴定出催化domain，为下一步研究打好基础。二级结构预测本地软件有Discovery Studio 2.5等。输入氨基酸序列后，可以得到二级结构如α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲。在线网站为http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/ ，具体操作方法可以百度，只需要输入氨基酸序列即可。三级结构蛋白同源建模，既可以使用在线网站Swiss-model，也可以使用本地软件Discovery Studio 2.5来实现。由于篇幅限制，Swiss-model同源建模法请自行百度，有大量优秀的在线教程可以讲授如何进行蛋白同源建模。案例2.1： Arribas-Hernã, et al. An m6A-YTH Module Controls Developmental Timing and Morphogenesis in Arabidopsis. Plant Cell (2018) 30(5):952 （案例解析：m6A-YTH组件调控拟南芥叶片发育时间和形态发生 | m6A专题）在这篇文章中，作者将不同物种的YTH家族蛋白序列放在一起，对保守区域的氨基酸序列进行了二级结构预测并标出了催化domain所在的氨基酸残基。之后还进行了蛋白3同源建模，对ECT2和ECT3蛋白几个关键的氨基酸残基进行高亮标注。这么做的原因是为了下一步做点突变做准备。如果要深入研究自己物种甲基化酶的作用，需要对具有催化domain的氨基酸残基所在碱基进行突变后，研究其功能，体内实验（in vivo）和体外实验（in vitro）都是需要的。案例2.2：Zhou, et al. RNA methylomes reveal the m6A-mediated regulation of DNA demethylase gene SlDML2 in tomato fruit ripening. Genome Biology 20.1 (2019): 1-23. （DNA甲基化调控m6A甲基化影响番茄果实成熟 | m6A专题）这篇文章中，中科院北京植物研究所秦国政课题组采用系统发育分析后发现，番茄S1ALKBH2/3/4与拟南芥ALKBHs具有高度相似，这些蛋白已被证明与植物发育及防御反应相关。同源序列比对分析表明，SlALKBH2含有与拟南芥ALKBH9B（AtALKBH9B）和小鼠ALKBH5（MmALKBH5B）一样高度保守的AlkB结构域。实验部分需要做的工作1. 体外验证甲基化酶功能前面的工作我们鉴定完了甲基化酶，下一步就要进行体外实验了。使用大肠杆菌或酵母表达蛋白，并进行纯化。下一步利用纯化的蛋白可以进行一系列体外验证工作，包括对甲基化酶催化domain所在的氨基酸残基进行突变后，与人工合成的mRNA进行反应，这些合成的mRNA本身A碱基都带有m6A修饰。另外甲基化酶家族，例如在拟南芥中ALKBH10、ALKBH3、ALKBH1这种不同亚型，要鉴定其是否对m6A是特异性去甲基化催化功能，也要做相应的验证实验。这些甲基化酶家族需要跟各种修饰如m1A、m5C、m6A、m1G等进行反应。案例1.1：Duan, H. C., et al. ALKBH10B is An RNA N6-Methyladenosine Demethylase Affecting Arabidopsis Floral Transition. Plant Cell 29.12(2017) （案例解析：拟南芥去甲基化酶ALKBH10调控成花转变 | m6A专题）作者以带m6A修饰的RNA为底物验证ALKBH10b催化活性，跟Control相比处理组明显m6A整体水平下降（图B）。对ALKBH10b的核心domain所在的H366A/E368A进行突变后验证其对m6A修饰的底物的去甲基化作用，表明去甲基化活性被突变后显著降低（图C）。另外作者还验证了ALKBH10b只对m6A有去甲基化修饰的催化活性，而对m1A基本没有任何影响。案例1.2 ：Martínezpérez, M., et al. Arabidopsis m6A demethylase activity modulates viral infection of a plant virus and the m6A abundance in its genomic RNAs. PNAS 114.40(2017):10755. （病毒m6A专题 | 拟南芥去甲基化酶调控病毒上m6A修饰）
在植物病毒研究中作者发现，宿主体内的无论是甲基化转移酶还是去甲基化酶都会去除病毒上的m6A修饰。这里作者从体外和体内证实去甲基化酶ALKBH9b对病毒上RNA的m6A修饰能起作用。案例1.3 ：Zhou, et al. RNA methylomes reveal the m6A-mediated regulation of DNA demethylase gene SlDML2 in tomato fruit ripening. Genome Biology 20.1 (2019): 1-23. （DNA甲基化调控m6A甲基化影响番茄果实成熟 | m6A专题）秦国政课题组对番茄的SlALKBH2蛋白进行纯化后，人工合成了一段有m6A修饰的ssRNA/oligo（14nt）作为底物进行去甲基化的体外反应实验。高效液相色谱HPLC对ssRNA/oligo进行分析后发现，体外重组蛋白SALKBH2能够有效去除ssRNA/oligo上的m6A修饰。为了进一步验证S1ALKBH2去甲基化酶的活性，作者将S1ALKBH2蛋白的CDS与HA标签单吧进行融合，并在本氏烟中进行瞬时表达。免疫印迹分析显示S1ALKBH2被成功表达。2. 不同甲基化酶在不同组织和时间点表达强度检测及m6A整体水平检测案例2.1（酶标仪法）： Duan, H. C., et al. ALKBH10B is An RNA N6-Methyladenosine Demethylase Affecting Arabidopsis Floral Transition. Plant Cell 29.12(2017) （案例解析：拟南芥去甲基化酶ALKBH10调控成花转变 | m6A专题）ALKBH家族所有蛋白编码基因在拟南芥不同组织不同发育时间点都进行了qPCR检测。这种方法的好处在于没有m6A报道的物种可以先在不同组织中检测不同的甲基化酶的表达强度，然后筛选出自己感兴趣的甲基化酶做深入研究。注意，RNA整体的m6A水平也要用酶标仪或者是LC-MS/MS检测一下。如果两个实验，也就是qPCR跟酶标仪做出来都没有差异，后面的实验不建议继续开展。案例2.2（质谱法）： Zhou, et al. RNA methylomes reveal the m6A-mediated regulation of DNA demethylase gene SlDML2 in tomato fruit ripening. Genome Biology 20.1 (2019): 1-23. （DNA甲基化调控m6A甲基化影响番茄果实成熟 | m6A专题）秦国政课题组利用中科院植物研究所质谱平台对果实成熟过程中DNA的5mC和RNA的m6A的动态水平使用LC-MS/MS进行了检测。果实成熟期无论是5mC还是m6A都出现整体下降，而Cnr突变体（比野生型WT具有更高DNA甲基化水平）在果实成熟时表现出更高的DNA 5mC修饰水平。作者推测DNA 5mC和RNA m6A修饰之间可能存在关联，并且mRNA m6A可能以DNA甲基化的方式参与调控番茄果实的成熟。3. 体内验证甲基化酶功能体内通常也会检测甲基化酶的功能，包括对组织提取RNA后检测m6A的整体水平，对甲基化酶敲除后影响其转录水平，或对催化domain的氨基酸残基进行突变后，检测RNA整体m6A水平是否有变化的同时，也要观察是否对植物表型发生变化。这一步的前提必须是老师必须自己要有构建突变体的技术。案例3.1： Duan, H. C., et al. ALKBH10B is An RNA N6-Methyladenosine Demethylase Affecting Arabidopsis Floral Transition. Plant Cell 29.12(2017) （案例解析：拟南芥去甲基化酶ALKBH10调控成花转变 | m6A专题） 作者针对ALKBH10b进行突变后，在拟南芥体内检测各种修饰是否发生变化，另外还对其他不同组织中m6A的比例进行了检测。案例3.2 ：Arribas-Hernã, et al. An m6A-YTH Module Controls Developmental Timing and Morphogenesis in Arabidopsis. Plant Cell (2018) 30(5):952 （案例解析：m6A-YTH组件调控拟南芥叶片发育时间和形态发生 | m6A专题）作者针对ECT2酶最核心domain所在的氨基酸残基进行突变，对拟南芥表型进行观察。同时还在拟南芥体内转入了报告基因载体观察其表达强度。到这一步，基本上就要建立起某甲基化酶和植物的表型之间的关系，也就是我们所说的相关性。案例3.3：Zhang, F., et al. The subunit of RNA N6-methyladenosine methyltransferase OsFIP regulates early degeneration of microspores in rice. PLoS Genetics. (2019) 5(5):e1008120. （水稻m6A甲基转移酶调控早期小孢子退化 | m6A专题）中山大学张月琴课题组对突变体水稻fip和mta2以及过表达水稻OXFIP和OSMTA2进行表型观察。在营养阶段，四种突变植物的表型看起来正常并且与野生型WT相似，只有纯合子植物的分蘖数（每株植物约1.4个分蘖）小于WT（每株约4.7个分蘖）。然而，在发育后期，与WT相比，fip几乎完全不育并且呈现缩短的圆锥花序和花药，并且有效种子数减少，而OXFIP具有更长的花药，更长的圆锥花序比，WT有更高的种子数和结实率。案例3.4：Zhou, et al. RNA methylomes reveal the m6A-mediated regulation of DNA demethylase gene SlDML2 in tomato fruit ripening. Genome Biology 20.1 (2019): 1-23. （DNA甲基化调控m6A甲基化影响番茄果实成熟 | m6A专题）秦国政课题组通过比较野生型和突变体在39、42、47和52DPA的果实后作者发现，去甲基化酶的番茄突变体slalkbh2-23、slalkbh2-25和slalkbh2-28出现了果实延迟成熟现象。在野生型中，42 DPA会观察明显的颜色变化，而突变体则仍然保持绿色。在DPA为47时，野生型果实具有均匀的橙色，而突变体的果实才刚刚开始变色。这表明S1ALKBH2是果实成熟的关键基因。4. m6A-seq常见标准分析罗列测序的目的主要是从下游挖掘究竟哪些基因的甲基化发生差异了，找到对应的靶基因后，就能开展后续的实验。这里的靶基因，最好先从感兴趣的“明星分子”出发。差异甲基化基因与转录本之间的关系可以分为四类，mRNA转录水平跟m6A水平同时上升或下调，以及mRNA转录水平跟m6A水平趋势相反。这里建议重点关注m6A水平上升而转录水平降低的mRNA，因为通常在哺乳动物中YTHDF2过表达的话会识别带有m6A修饰的mRNA，然后将其降解。其他的诸如YTHDF1促进翻译等也可以重点关注。在数据展示上下面我会根据几篇文章中结果来说明一些常见图表罗列形式。案例4.1： Duan, H. C., et al. ALKBH10B is An RNA N6-Methyladenosine Demethylase Affecting Arabidopsis Floral Transition. Plant Cell 29.12(2017) （案例解析：拟南芥去甲基化酶ALKBH10调控成花转变 | m6A专题）在这篇Plant Cell中，贾桂芳课题组的段洪超博士主要将测序数据中的Venn图、热图、火山图、Peak在mRNA上reads归一化整体趋势分布图、motif分析、Peak在CDS即UTR区的注释饼图等做了展示。案例4.2：Miao, Z., et al. Evolution of the RNA N6-methyladenosine methylome mediated by genomic duplication. Plant Physiology (2019): pp.00323 （客户文章 | Plant Physiology玉米m6A进化由基因组重复事件介导）在这篇文章中，马闯课题组展现了强大的生信分析能力，需要大家认真学习。下面将文章中主要的一些图进行罗列① peak归一化后整体趋势图，基本上都集中在3’ UTR和终止密码子附近。② 饼图意义在于总结一个样本或者整体样本中，peak落在的区域总结。该样本中绝大部分为3’ UTR。③ 使用了MEME和HOMER两款软件进行motif分析。最终结果表明有大约超过90%的peaks含有m6A的经典motif RRACH（R=A/G; H=A/C/U）。此外另一个属于植物m6A特有的motif URUAY（R=A/G; Y=C/U）也被鉴定了出来。④ 无论是Han21玉米还是B73玉米，差异甲基化Peak（DMP）绝大部分都富集在3’ UTR。B73 DMP GO富集分析表明，3’ UTR DMP大量富集在蛋白磷酸化和细胞凋亡调控上，终止密码子DMP大量富集在组蛋白替换和细胞质翻译上。Han21 DMP GO富集分析表明，3’ UTR DMP大量富集在转录调控和蛋白转运上，DMP附近的基因则大量富集在光修复/光复活以及siderophore biosynthetic process。以上结果表明B73和Han21的m6A基因差异较大，调控上有各自独有的调控模式。
⑤ VI2是拟南芥根系伸长的一个调节因子。在干旱胁迫期间，Han21中VI2上m6A peak甲基化水平降低了两倍以上。参与拟南芥根系生长、细胞分裂和根系结构的肌动蛋白基因家族蛋白Actin-7（ACT7）m6A peak在B73干旱胁迫样品中也呈现甲基化。这个图为具体某个基因的peak呈现形式，不同样本之间m6A在mRNA上富集程度可以直观地显示出来。IGV软件可以根据bigwig格式直接呈现相似图片。5. 后期验证其他相关工具罗列这类实验基本上已经到很后期了，比如挖掘到某个基因m6A甲基化水平发生了差异，那么下一步就需要对该基因构建突变体，观察植物表型是否有差异。难点依然在于部分植物无法构建突变体。如下图所示，作者通过构建ECT2这个reader的突变体后观察拟南芥表型，发现发育受到很大的影响。但是这往往是不够的。案例5.1 ：Duan, H. C., et al. ALKBH10B is An RNA N6-Methyladenosine Demethylase Affecting Arabidopsis Floral Transition. Plant Cell 29.12(2017) （案例解析：拟南芥去甲基化酶ALKBH10调控成花转变 | m6A专题）
如果到这一步，基本上会对具体感兴趣的差异明星分子进行后期的实验。文中我们可以看到FT会影响拟南芥的发育。由于这部分内容很多老师都比较熟悉，故不做大篇幅介绍。另外烟草瞬转实验可以考虑下，假如不能构建突变体。案例5.2 ：Zhou, et al. RNA methylomes reveal the m6A-mediated regulation of DNA demethylase gene SlDML2 in tomato fruit ripening. Genome Biology 20.1 (2019): 1-23. （DNA甲基化调控m6A甲基化影响番茄果实成熟 | m6A专题）秦国政课题组将番茄的S1ALKBH2蛋白CDS在C端与eGFP荧光蛋白进行融合后，将构建好的载体用农杆菌侵染本氏烟，然后将分离好的原生质体在共聚焦显微镜下进行观察。结果表明，带有eGFP标签的S1ALKBH2在内质网中出现了强烈的荧光信号，而eGFP对照仅在除了液泡腔外的整个细胞中产生了荧光信号。SlALKBH2-eGFP的荧光信号与带有His-Asp-Glu-Leu（HDEL）标签的红色荧光蛋白（RFP-HEDL）进行了共定位，证实了S1ALKBH2的确定位在内质网中。作者使用瞬时表达系统在本氏烟草中将S1ALKBH2启动子克隆到双萤光素酶报道质粒，该质粒含有萤火虫萤光素酶（Fluc）报告基因和海肾萤光素酶（Rluc）报告基因。当SlDML2与携带有双荧光素酶报告基因的质粒共表达时，相对Fluc活性和Fluc转录水平出现显著上升。作者使用SlALKBH2的多克隆抗体对SlALKBH2进行RIP实验后发现，S1ALKBH2蛋白和SlDML2的mRNA之间存在直接互作，而与NR或FUL2的mRNA没有直接互作。使用放线菌酮（actinomycin D）处理后发现，SlDML2 mRNA迅速降解。但是当S1ALKBH2与SnDML2在本氏烟草中共表达时，SlDML2的m6A修饰水平显著下降，半衰期有所增加（即降解速度显著下降，SlDML2稳定性增加）。当SlDML2中m6A修饰位点中的A碱基突变为C碱基时，mRNA降解速度也显著下降稳定性增加。当SlDML2的A→C突变mRNA与S1ALKBH2蛋白共表达时，进一步降低了S1DML2 mRNA的降解率。相关阅读