口腔菌群研究宝典来啦！| 微生物专题

从氧气稀薄的万里高空到幽暗寒冷的海洋深处，从赫赫炎炎的火山爆发口到白雪皑皑的冰川之巅都存在微生物的身影，在蔚蓝色的星球上微生物无处不在。

根据人类微生物组计划实验结果，人体中主要由4个菌群栖息地，分别是口腔，肠道，生殖道以及皮肤。在这些部位都存在着数量和种类惊人的微生物，从数量上微生物占据了绝对的优势，人体细胞一共40万亿个，而微生物有100万亿个！ 

其中肠道是人体中微生物数量种类最多的一个部位，目前对肠道微生物的研究较为广泛深入。但是位于消化道上端的口腔同样也是一个微生物聚集的重要位点。12年在NATURE上发表的HMP（Human Microbiome Project人类微生物组计划）实验结果显示，口腔中唾液和牙菌斑的微生物多样性仅次于肠道。

过去上百年间人们对口腔菌群的研究主要依靠分离和培养的方法，这对微生物的发现有较大的局限性，一些丰度较低或者是不能在体外培养的微生物无法被鉴定。但随着近十年间高通量测序技术的飞速发展，人们对口腔微生物的认识日新月异。根据HOMD（人类口腔微生物组）数据库报道，近千种口腔微生物已被鉴定，包括细菌、病毒、真菌、支原体等微生物物种。

由于口腔微生物和口腔取样部位的多样性，取样的便捷性、菌群的多样性，以及与口腔疾病的关联、与全身系统性疾病的关联，这些诸多的优点，使得口腔越来越被大家所认识，同时也有越来越多的人参与到口腔研究当中来。

那么口腔菌群的研究中如何利用高通量测序这一工具呢？那当然是运用我们的宏基因组学研究策略啦！

这种方法把口腔中的微生物群看成整体，直接采用基因组学技术开展研究，不需要在对微生物菌群进行分离和培养，大大提升了人类微生物组研究的深度和广度。

通过宏基因组学研究策略，研究者们可以对微生物组研究的三大问题进行回答：

1）Who is there? ；2）What can they do? ；3）What are they doing?

1） Who is there?

首先需要回答微生物群的组成结构，即特定生境如口腔中都有什么微生物群。

解决这个问题最直接高效的方法是采用针对目标基因的扩增子测序，比如鉴定细菌群落组成的16S rRNA基因测序，鉴定真菌群落组成的 ITS（Internal Transcribed Spacer）测序。扩增子测序无法提供菌群所携带的基因信息。

16S rRNA基因测序原理

2） What can they do?

其次研究者们需要回答这些微生物群能做什么，即它们携带哪些基因，可能发挥哪些功能、参与哪些代谢途径。

对于这个问题的研究手段目前主流的方法是采用宏基因组测序，即对包括细菌、真菌、病毒等各种微生物的基因组进行测序，鉴定微生物群携带的基因信息，分析得到基因的功能和可能参与的代谢途径。

3） What are they doing?

最后研究者们需要指这些微生物群正在发挥怎样的功能，比如菌群的功能活性是怎样的，这些具有功能活性的菌群翻译出了哪些蛋白质、以及产生的代谢物正在对宿主施加怎样的影响。

如在转录水平检测具有功能活性的微生物群结构，可以用宏转录组（Metatranscriptome）测序；如检测具有功能活性的微生物群翻译出来的蛋白质信息，可以用宏蛋白质组（Metaproteome）分析；如检测具有功能活性的微生物群产生的代谢物信息，可以用代谢组（Metabolome）分析。

多组学分析人体微生物群

由于实验技术和分析方法（包括数据库）还不够完善，目前微生物群的检测工作主要集中在DNA水平（扩增子测序和宏基因组测序）和代谢物水平（即代谢组检测）。由于口腔菌群中细菌群落占大多数，因此口腔菌群最常用的检测方法是16S rRNA基因测序、宏基因组测序和代谢组分析。

另外需要引起注意的是，细菌的功能是菌株专一性的。在细菌的分类学中，一个“种（species）”内可以含有不同的菌株（strain），其基因组同源性最多可以相差30%，即属于同一个种的2个不同菌株之间的遗传差异，甚至能超过人与小鼠之间的遗传差异，后者间的遗传差异仅有10%。因此，在研究菌群与疾病间的关系时，要尽力识别到菌种甚至菌株水平（如使用宏基因组测序），才有可能发现和鉴定出影响人体疾病发生、发展的关键的种水平的细菌。

通过以上的内容相信大家肯定对研究菌群宏基因组策略有了大致的了解，但是在我们实际的研究过程中还需要根据口腔菌群的特点去做调整。最简单的一个例子，口腔有那么多部位（舌头、牙齿、唾液……），应该在哪里取样？用什么数据库？如何鉴定菌群？

遇到问题别担心！有联川专业团队在！我们围绕实战中老师们高频关心的问题精心收集资料，融入项目经验，编写了《口腔菌群研究手册1.0》为您的口腔菌群研究之路保驾护航！

参考文献

1. Danser MM, Gómez SM, Van der Weijden GA. Tongue coating and tongue brushing: a literature review. Int J Dent Hyg. 2003; 1: 151-8.

2. Lim Y, Totsika M, Morrison M, Punyadeera C. Oral Microbiome: A New Biomarker Reservoir for Oral and Oropharyngeal Cancers. Theranostics. 2017 Sep 26;7(17):4313-4321.

3. Willis JR, Gabaldón T. The Human Oral Microbiome in Health and Disease: From Sequences to Ecosystems. Microorganisms. 2020 Feb 23;8(2):308.

4. Kitamoto S, Nagao-Kitamoto H, Hein R, et al. The Bacterial Connection between the Oral Cavity and the Gut Diseases. J Dent Res. 2020 Aug;99(9):1021-1029.

Morgan XC, Segata N, Huttenhower C. Biodiversity and functional genomics in the human microbiome. Trends Genet. 2013 Jan;29(1):51-8.

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