文献解读：17分文章带你了解cGGNBP2编码的新蛋白在肝内胆管癌细胞生长和转移中的作用
发表单位：四川大学华西医院
发表期刊：Hepatology
影响因子：17.42
一直以来，CircRNA都被认为是非编码RNA，主要功能是作为miRNA分子海绵和蛋白质支架，然而，最近的研究表明，CircRNA也可以与核糖体结合，可能有蛋白编码潜能。此外，最新的研究表明，circRNA也可以介导内部核糖体进入位点（IRES）诱导的蛋白质翻译（所谓的IRES，指的是一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于5‘帽结构，从而使直接从信使RNA（mRNA）中间起始翻译成为可能），而这些CircRNA编码的蛋白被证明可以调节肿瘤发生和转移标志物。
目前已被证实，白细胞介素（IL）-6（IL-6）同样可以调节抗凋亡和增殖基因，促进肿瘤的发生。然而，IL-6与环状RNA（circRNAs）是否有作用关系或其他机制尚不清楚。
肝内胆管癌（ICC）约占原发性肝癌的10%-15%，近年来高收入国家的发病率呈显著上升趋势。由于频繁的转移和术后快速复发，ICC的预后仍然很差。
因此，作者希望通过了解ICC转移的确切分子机制来开发新的有效转移靶向治疗方法，改善ICC患者的预后。
cGGNBP2被IL-6上调表达，并与ICC患者的预后相关
血清IL-6已被证明与不同癌症的预后相关，包括肝癌。作者首先研究了血清IL-6在ICC中的预后价值，结果表明，血清IL-6水平升高与肿瘤体积大、肿瘤数量多、淋巴结浸润和预后差显著相关（如下图所示）。为了确定这个过程中潜在的分子机制，作者在不同浓度和时间点用IL-6处理ICC细胞（RBE）。
如图所示，随着IL-6浓度的升高，纺锤形外观增加，这说明细胞显示出更强的侵袭能力。
IL-6治疗还能增强HuccT1细胞的侵袭能力，但不能增强正常胆管细胞（HIBEpiC）的侵袭能力（图C-D）。
作者通过RNA-seq获得了circRNA表达谱，在环状RNA数量方面，共鉴定出3951个不同的环状RNA，再通过与circBase数据库收录的已知circRNA取交集，发现有3055个已被circBase收录，其中3737个（94.6%）由外显子组成。有9个circRNA在通过IL-6处理后显著上调。
在circRNA表达量方面，circRNA GGNBP2（染色体17q12，GGNBP2基因外显子3-6的circRNA）被发现在9个上调的circRNA中上调最显著。(这些结果都被qRT-PCR证实)
为了进一步确定cGGNBP2的临床相关性，作者在136例ICC组织和邻近的非肿瘤组织中评估了cGGNBP2的表达水平。结果表明，cGGNBP2在肿瘤中的表达水平远高于非肿瘤（图F）。此外，肿瘤组织中cGGNBP2的表达水平与血清IL-6水平呈正相关。值得注意的是，cGGNBP2的表达、血清IL-6水平在ICC和肝血管瘤患者中没有显著差异（图G）。
由于ICC富含间质和癌相关成纤维细胞，作者随后评估了20例患者ICC细胞、非癌胆管细胞和癌相关成纤维细胞（CAF）的cGGNBP2表达，结果表明，cGGNBP2在CAF中的表达极低。此外，与非癌胆管细胞相比，ICC细胞中的cGGNBP2表达更高。
另一方面，cGGNBP2的表达与肿瘤组织中IL-6受体（IL-6R）和IL-6的表达呈正相关。敲除IL-6R后，ICC细胞中cGGNBP2表达下调（图K）。而且，在IL-6R缺失的细胞中，即使进行IL-6处理也不能上调cGGNBP2（图L）。
以上我们可以得知，cGGNBP2可被IL-6调节，那么cGGNBP2表达与临床病理特征及患者预后的是不是也有潜在关联呢？作者发现，cGGNBP2表达升高与血清糖类抗原19-9水平升高、肿瘤体积增大、肿瘤数量增多、淋巴结转移更晚期的肿瘤阶段显著相关，表明cGGNBP2与ICC进展相关。
综上所述，cGGNBP2被IL-6上调，且可能作为ICC患者的预后因素。
据报道，一些RNA结合蛋白（RBPs）可通过结合特定序列来调节circRNA的后剪接，参与circRNA的生物合成。为了研究RBPs是否参与cGGNBP2的形成，作者通过RNA-seq获得了11种RBPs在IL-6处理的细胞中的表达谱，这些RBPs都被报道可影响circRNA的生成。
数据表明，IL-6处理后， DHX9发生显著改变。为了证实RNA-seq结果，作者用IL-6处理RBE和HuccT1细胞，并计算DHX9的mRNA和蛋白质表达水平。结果证实DHX9可被IL-6下调（图B-C）。此外，ICC患者肿瘤组织中DHX9的表达与血清IL-6水平、cGGNBP2的表达与DHX9组织化学评分均呈负相关（图D）。DHX9沉默后，cGGNBP2表达水平可显著上调（图E），随后，作者又进行了DHX9的过表达，发现与沉默DHX9的结果相反。
综上所述，IL-6处理可下调DHX9，更重要的是，DHX9下调之后可以上调细胞中cGGNBP2的表达。
为了阐明cGGNBP2在ICC细胞生长和转移中的生物学功能，作者在Hccc9810和HuccT1细胞中通过靶向反向剪接序列的小干扰RNA（siRNA）敲除cGGNBP2，并在RBE和HuccT1细胞中过表达cGGNBP2。结果表明cGGNBP2基因敲除显著抑制细胞增殖、细胞周期和细胞侵袭能力，而cGGNBP2的过度表达具有相反的效果（体外和体内都是如此）。
此外， cGGNBP2基因敲除可消除IL-6诱导的ICC细胞增殖和侵袭的大部分作用（图A-C）。
综上所述， cGGNBP2在体外和体内促进ICC细胞生长和转移方面具有功能性作用。
上面已经提到过，有些circRNA也是有编码蛋白质潜能的，为了检测cGGNBP2是否也有这一潜能，作者首先分析了circRNADb中注释的cGGNBP2的ORF和IRES。检测到具有编码184aa蛋白潜力的高度保守的ORF。根据检测到的ORF预测出了蛋白序列，命名为cGGNBP2-184aa（如下图所示），随后的质谱分析证实，氨基酸序列与假定的cGGNBP2-184aa序列高度一致。
作者通过构建IRES-MUT载体，发现cGGNBP2编码cGGNBP2-184aa以促进ICC细胞体外增殖和转移。
为了进一步阐明cGGNBP2-184aa诱导ICC细胞生长和转移的机制，从IRES-MUT和OE-cGGNBP2细胞中提取RNA，并进行RNA seq。共有292个上调基因和240个下调基因差异表达。基于GO和KEGG富集分析，cGGNBP2-184aa过度表达显著影响了JAK-STAT信号通路，而GSEA富集分析也证明cGGNBP2-184aa过度表达对JAK-STAT通路和细胞周期过程有正向的影响。
STAT3是JAK-STAT途径的主要分子，是一种关键转录因子，对多种人类癌症的进展具有关键作用。由于STAT3核易位和转录活性需要磷酸化，所以作者随后研究了cGGNBP2-184aa是否调节STAT3磷酸化。异位cGGNBP2-184aa表达显著增强了STAT3在Tyr705处的磷酸化和RBE细胞中STAT3蛋白水平（图B）。
此外，cGGNBP2-184aa的缺失对STAT3Tyr705磷酸化的抑制可通过在HuccT1细胞中过度表达cGGNBP2-184aa ORF来挽救（图C）。然而，STAT3Ser727磷酸化不受cGGNBP2-184aa表达变化的影响。接下来，为了检测STAT3的易位，作者进行了亚细胞蛋白质组分分析。cGGNBP2-184aa过表达显著加速磷酸化STAT3Tyr705的核易位，而磷酸化STAT3Ser727和总STAT3的核表达则没有变化（图D）。
cGGNBP2-184aa ORF在cGGNBP2敲除细胞中的过度表达恢复了磷酸化STAT3Tyr705的核分布，而不改变STAT3Ser727，这与上述结果与此一致。有趣的是，在增强cGGNBP2-184aa后，总STAT3的核表达显著增加。
cGGNBP2沉默的HuccT1细胞中的表达（图E）。
综上所述，cGGNBP2-184aa促进STAT3Tyr705磷酸化、核易位和JAK-STAT通路的激活。
为了进一步证实cGGNBP2-184aa过表达激活JAK-STAT通路，作者进行了双荧光素酶实验，以测量STAT3反应元件的荧光素酶活性。正如预期的那样，cGGNBP2-184aa上调表达显著增强了STAT3反应元件的活性。cGGNBP2-184aa水平的恢复大大消除了沉默cGGNBP2对HuccT1细胞中STAT3元件荧光素酶活性的抑制作用（图F）。
此外，STAT3靶基因的mRNA表达水平也受到cGGNBP2沉默的抑制，并通过cGGNBP2-184aa ORF的过度表达得以恢复（图G）。
鉴于先前的研究已经报道，IL-6处理可增强Tyr705处STAT3的磷酸化，作者检测了不同浓度和时间的IL-6处理的ICC细胞中STAT3Tyr705的磷酸化。STAT3Tyr705磷酸化随着IL-6浓度的增加而逐渐升高。然而，cGGNBP2-184aa敲除消除了IL-6对STAT3Tyr705磷酸化的促进作用，也消除了IL-6诱导的JAK-STAT信号激活。
为了更好地阐明cGGNBP2-184aa上调STAT3TYR705磷酸化的机制，作者应用共同免疫沉淀证实了cGGNBP2-184aa与STAT3之间的相互作用，此外，免疫荧光染色验证了cGGNBP2-184aa和STAT3在ICC细胞细胞质中的共定位（图A-C），并验证了cGGNBP2-184aa的结合区与JAK-STAT信号的激活有关。换句话说，cGGNBP2-184aa与STAT3相互作用，激活JAK-STAT信号通路，并促进细胞增殖和转移。
越来越多的证据强调炎症与癌症进展之间的联系。IL-6是一种多功能细胞因子，在各种肿瘤中均过度表达，并影响肿瘤的增殖、侵袭和转移。先前的研究结果表明，IL-6水平升高与ICC中更具侵袭性的肿瘤特征和不良预后显著相关。作者进行的高通量测序结果表明，IL-6可以诱导CircRNA的表达以促进ICC的进展，且IL-6诱导的cGGNBP2可以编码一种新的蛋白cGGNBP2-184aa。异位cGGNBP2-184aa表达促进ICC细胞在体内外的生长和转移。更重要的是，cGGNBP2-184aa直接与STAT3相互作用，并增强其在Tyr705位点的磷酸化，随后转运到细胞核以激活靶基因的转录。也就是说，IL-6/cGGNBP2-184aa/STAT3形成一个正反馈回路，以维持ICC中IL-6/STAT3信号的激活。这个发现揭示了IL-6诱导肿瘤进展的一种新机制，可能为ICC的临床IL-6/STAT3靶向治疗提供了一个辅助靶点。
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