植物单细胞原生质体难制备怎么办？植物抽核帮你忙 | 单细胞专题
植物各个组织中单个细胞协同作用赋予植物组织不同的功能。单细胞测序技术应用于植物，有助于揭示植物发育和胁迫适应所涉及的基本细胞活动。基于微流体的单细胞RNA-seq(scRNA-seq)方法的最新进展，可以研究任何特定生物体在细胞分辨率下的转录变化。在以动物为基础的研究中，scRNA-seq已经彻底改变了细胞研究现状。除了促进发现新的细胞类型外，单细胞测序还可以研究细胞基因调控网络中的机制和原理，以及细胞命运决定和器官功能背后的基因表达水平变化。
对于植物来说，单细胞实验在收集细胞之前，需要通过酶消化去除细胞壁(原生质体制备)。而植物原生质体制备存在以下几个难点：①植物细胞被固定在刚性细胞壁基质中，分离单细胞时需要将其移除；②植物细胞壁的酶消化是一种重要的胁迫源，容易刺激植物细胞出现应激反应，诱导压力应答基因的表达，人为引入转录偏差；③植物原生质体大小存在可变性（渗透压导致的原生质体胀大）；④质体细胞器、和液泡中存在可与RNA相互作用的次级代谢物；⑤不同组织类型间适用的酶组合不同，需要优化消化细胞壁所需的酶；⑥制备的原生质体很脆弱，活性波动大。
为了解决植物原生质体进行单细胞测序所遇到的问题，来自美国内布拉斯加大学林肯分校的Marc Libault课题组构建了植物单细胞核转录组测序的方法技术，用以分析植物细胞核内的转录组和染色质可及性，从而描绘新的植物细胞类型图谱。此研究于2021年3月份以“Single-nucleus RNA and ATAC sequencing reveals the impact of chromatin accessibility on gene expression in Arabidopsis roots at the single cell level”为题发表在期刊Molecular Plant（IF=13.164） 。利用单核转录组测序，作者在单个植物核水平上进行了ATAC-Seq实验。将单核ATAC-seq(sNucATAC-seq)技术应用于数千个单个细胞，揭示了染色质可及性的更精细的植物细胞轮廓。 同时，Marc Libault课题组无偿将植物单细胞ATAC-seq实验方法发表在了期刊Bio-protocol上。联川在第一时间对此protocol进行了翻译，希望对各位读者有所帮助。
整个实验步骤分为细胞核分离、纯化和提高核膜通透性。细胞核分离步骤：在NIB培养基中磨碎植物样品，过滤得到细胞核（图1A）；纯化：利用孔径更小的滤膜过滤掉杂质或利用流式细胞仪进一步纯化细胞核（图1B）；提高核膜通透性：通过加入Triton X-100提高核膜的通透性，便于后续Tn5转座酶进入细胞核（图1C）。最后，利用10× Genomics提供的缓冲液重悬细胞核至合适的密度，进入后续的测序建库步骤（图1D）。
图1 与单核ATAC-SEQ文库构建兼容的核分离、纯化和渗透工作流程
一. 实验试剂及耗材
二. 实验步骤
采集植物样本前30分钟，将所有材料和试剂冷却至4 °C(即培养皿、手术刀片、枪头、锥形管、细胞滤膜)。在整个过程中将样品和分离的细胞核保持在4°C是至关重要的，以降低应力水平并最大限度地保持核膜的完整性。最终，核膜完整性的降低会导致文库构建过程中核破裂率的增加，核回收率降低，文库片段产量降低。
1. 收集100~1000 mg的新鲜植物样本，将其放入60 mm培养皿中，加入500μL预冷的NIB培养基。
2. 用手术刀片在NIB培养基中切碎植物组织约30 s。
3. 用预冷的NIB培养基浸没切碎的植物组织，以保持样品的湿润(平均每克切碎的植物组织需要1 mL的NIB培养基)，避免使用过量的NIB培养基，因为这会使样品切碎变得困难。
4. 将植物组织再切细4 min(即切碎的样本应容易用1 mL大口径尖端枪头吸起)
5. 将一个40 μm滤膜置于一根50 mL倾斜于冰上的锥形管的顶部。用500 μL的预冷NIB培养基预润湿。
6. 使用移液枪将核-NIB混合物轻轻转移到滤膜顶部。
7. 在60 mm培养皿中加入1 mL预冷的NIB，洗涤并收集剩余的细胞核。用1 mL大口径移液枪轻轻地将此体积转移到40μm滤膜中。
当处理直径小于30µm的植物细胞核(例如，海棠根细胞核)时，使用选项1。如果细胞核直径大于30µm，使用选项2。强烈建议在开始构建文库之前，按照下述操作来去除较大的细胞碎片。防止在油包水形成过程中，细胞碎片堵塞微流控系统，阻止油包水形成，并导致细胞文库的部分或全部丢失。
1. 如步骤A5所述，再准备一根50 mL锥形管，但使用30μm滤膜。
2. 使用1mL大口径移液枪，将从步骤A7过滤的核-NIB培养基混合物轻轻转移到30 μm滤膜上。
3. 在显微镜下执行第一次核质量检查；检查是否有碎片污染：
a. 将装有核混合物的50 mL锥形管和10 μL吸管轻轻旋转到微型载玻片上。
b. 加入最终浓度为0.5 μM的SYTOX Green DNA染色，用盖玻片盖住微型载玻片。
c. 使用荧光显微镜，寻找细胞核悬浮液中细胞碎片的潜在污染。
4. 要清除剩余的碎片，请按照备选方案1-步骤1和步骤2.4中的说明，使用另一个30 μm或20 μm滤膜过滤细胞核再悬浮。在确认分离的细胞核的质量和纯度后，进入步骤C。
图2. 用20µm细胞滤膜纯化前(A)和纯化后(B的)植物细胞核显微图片(物镜40×)
1. 设置单元格分类器。
A. 使用100µm喷嘴和20磅/平方英寸的默认系统压力，以最大限度地减少分选过程中对细胞核的应力。
B. 在分拣前和分拣过程中，将样品和采集室冷却至4 °C。
2. 转移和分选200 µL未染色的细胞核，建立细胞核分选的基线。
3. 在细胞核悬浮液中按v/v 1：40的比例加入7-AAD(即每1 mL细胞核混合物加入25 μL的7-AAD)。在分选之前，在冰上孵化至少30 min。注：到目前为止，7-AAD是唯一通过10x Genomes验证可以进行单细胞核ATAC-seq实验的染料。根据10X Genomes 研究，7-ADD不会干扰Tn5转座酶活性。
4. 使用BD FACSAria II细胞分类器或具有类似光谱特性的细胞分类器对样品进行分类。
A. 用561 nm激光激发7-AAD信号，使用635长通(LP)滤波器和660/20带通(BP)滤波器的组合检测其发射。
B. 在正向与侧向散射(FSC与SSC)上显示和选通初始信号，以去除不需要的非核事件和碎片。随后，在7-AAD高度(7-AAD-H)与7-AAD宽度(7-AAD-W)曲线图上显示数据，以允许去除额外污染物。
C. 对于难以区分的7-AAD染色的细胞核和自发荧光细胞器，使用显示7-AAD和相邻荧光的双变量图的方法(即488 nm激发激光和600LP和610/20bp的滤膜组)，此方法能够更好地区分样品和细胞器的7-AAD阳性细胞核部分。在这种结构中，细胞核部分稍微远离细胞器，使得染色的细胞核能够被门控和分选。
图3. 使用BD FACSAria II细胞分类器分离细胞核的门控策略
5. 收集已分选的细胞核，放入15 mL锥形管中，内含1 mL预冷的1%牛血清白蛋白-磷酸盐缓冲液(BSA-PBS)。
6. 为确认收集到的细胞核的纯度，样品经SYTOX Green染色(最终浓度为5 nm)后分选一等份。Sytox Green荧光用488 nm激光激发，用505LP和530/30bp的滤光片收集。
7. 将7-AAD分选后的细胞核在4 °C下500 ×g离心10 min。
8. 去掉上清液，在150 μL的1%牛血清白蛋白-硫代巴比妥钠溶液中轻轻地重新悬浮细胞核。
1.在细胞核悬液中加入1 % NIB培养基(如果使用选项1步骤B)或1 %BSA-PBS(如果选项2步骤B)，并添加2 % Triton X-100，以达到0.5 %的最终Triton X-100浓度(例如，每1.5 mL NIB过滤细胞核悬液添加0.5mL NIB培养基 + 2 % Triton X-100，或添加50μL的1 % BSA-PBS + 2 % Triton X-100)。
2.在4°C(速度2)下对拟南芥进行温和摇晃5 min。
3.将拟南芥细胞核在500 ×g和4 ℃下离心8 min，将其制成颗粒核，在500 ×g和4 ℃下离心5 min，得到大个颗粒核(时间和速度因植物种类和细胞核大小而异)。去掉上清液。
4.用4 mL 1 % BSA-PBS洗涤颗粒。通过旋转轻柔地使细胞核颗粒重新悬浮。
5.如步骤C3所述对细胞核悬浮液进行离心。去掉上清液。
6.用10× Genomes公司提供的20μL的1×细胞核缓冲液重新悬浮细胞核颗粒。体积可以根据细胞核浓度进行调整，以满足10X Genomes要求(即每个样本使用的最大体积被限制为最多5 μL，核浓度在155到7,700核/μL之间)。
1. 将9 μL的核悬浮液(从步骤C6开始)转移到新的锥形管中。
2. 加入1 µL的0.4 %台盼蓝，轻轻搅拌。
3. 将染色细胞核全部体积转移到细胞计数室载玻片中。选择大小在2-30 µm 之间的台盼蓝阳性细胞核。
4. 估算核密度。
5. 按照10X Genomes协议，使用Chromium Next GEM Single Cell ATAC Library & Gel Bead Kit (PN-1000175/6)、 Chromium Next GEM Chip H Single Cell Kit(PN-1000161/2)、 Single Index Kit N, the Set A (PN-1000212)和 Chromium Controller (1000202/4)进行单细胞核ATAC-seq文库构建。
参考文献
[1] Farmer A, Thibivilliers S, Ryu KH, Schiefelbein J, Libault M. Single-nucleus RNA and ATAC sequencing reveals the impact of chromatin accessibility on gene expression in Arabidopsis roots at the single-cell level. Mol Plant. 2021 Mar 1;14(3):372-383. doi: 10.1016/j.molp.2021.01.001. Epub 2021 Jan 7. PMID: 33422696.
[2] Thibivilliers, S. B. et al. (2021). Isolation of Plant Nuclei Compatible with Microfluidic Single-nucleus ATAC-sequencing. Bio protocol 11(23): e4240. DOI: 10.21769/BioProtoc.4240.
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