用户文章 | 单细胞测序助力解析自身免疫性脱髓鞘发病机制

山东大学基础医学院的刘奇迹教授领导的研究团队于2021年在《Journal of Neuroinflammation》（IF=8.322）上发表的关于中枢神经系统脱髓鞘疾病研究成果，其研究表明Smek1在自身免疫性脱髓鞘发病机制中可能通过免疫抑制和中枢神经系统炎症调节发挥保护作用。这项成果为Smek1在EAE中的作用提供了具有指导意义的基础，并拓宽了对参与自身免疫脱髓鞘发病机制的遗传因素的理解。

实验背景

 中枢神经系统脱髓鞘疾病是以中枢神经系统多灶性以及炎性脱髓鞘为主的一种自身免疫系统疾病，近年来发病率渐高。临床上较常见的脱髓鞘疾病包括多发性硬化症和视神经脊髓炎等。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是一种涉及免疫系统和中枢神经系统(CNS)的多发性硬化(MS)动物疾病模型，以免疫系统和中枢神经系统(CNS)免疫功能异常导致脱髓鞘为特征。Smek1作为PP4（Protein phosphatase 4）的一个亚基，此前研究已被发现在趋化性、神经发生、神经元分化和衰老中发挥作用。在这项研究中，研究人员探究了SMEK1的部分功能缺失如何导致MS和EAE的发生。

结果

首先，研究人员使用loxPCre系统生成Smek1敲除小鼠。在C57BL/6菌株中观察到Smek1-/-小鼠大量产前死亡。因此，后续实验采用C57BL/6 Smek1-/+小鼠进行进一步的动物实验。

SMEK1减少导致EAE模型中症状加重

为了研究SMEK1在CNS自身免疫性疾病中的作用，研究人员首先使用了来自正常对照组和MS患者外周血和脑组织的GEO转录数据，分析结果显示人MS外周血单个核细胞和MS脑病变中SMEK1水平均降低。为了进一步研究Smek1在自身免疫脱髓鞘中的作用，研究人员通过MOG35-55免疫Smek1-/+小鼠和野生型同窝小鼠建立了EAE模型，术后第13天出现症状。在整个病程中，Smek1-/+小鼠的临床评分高于对照组小鼠。研究人员从MBP染色、免疫组化染色发现，与野生型小鼠相比，Smek1-/+ EAE小鼠的小胶质细胞与巨噬细胞显著累积，NF-κ b通路被激活。(图1)

图 1

Smek1杂合性促进小胶质细胞活化和中枢神经系统炎症

鉴于Smek1杂合性在EAE组织标本中显示出iba1阳性细胞的积累，研究人员推测Smek1表达的杂合性足以促进小胶质细胞的激活，介导神经炎症。他们发现与野生型小鼠相比，EAE Smek1-/+小鼠白质、皮质和脊髓中激活的小胶质细胞数量和强度更，EAE Smek1-/+小鼠的脑IL-1β mRNA表达水平升高。并且，他们通过在人小胶质细胞HMO6中建立了plvx-SMEK1-puro和shSMEK1细胞株，分析相应对照组IL-1β mRNA水平，与之前的结果一致(图2 )。

图 2

Smek1缺乏导致形成一个独特的促炎小胶质簇

对野生型和Smek1-/-小鼠(每组2只，2月龄)的皮质和海马样本进行单细胞测序并分析，鉴定出12000多个细胞，分为12个细胞亚型。用小胶质细胞特异性标记物——集落刺激因子1受体(Csf1r)来区分小胶质细胞。研究人员观察到Smek1-/- cluster 3比野生型cluster中IL-1β表达水平更高， IL-1β阳性细胞更多。证据表明，在Smek1-/- CNS中存在一个预激活和促炎症的小胶质簇。(图3 )

图3

通过亚群标记揭示cluster 3的异质性。进一步分析发现，cluster 3中巨噬细胞Csf1富集。smek1缺失的小胶质细胞伪时间分析结果热图显示促炎细胞因子上调，包括IL-1β。基于Smek1-/-小鼠的情况，研究人员进一步研究了Csf1在Smek1-/+小胶质细胞中的时空表达特征，进而发现在Smek1部分或完全丧失功能的情况下，一种新的Csf1+小胶质细胞簇具有可促进神经炎症的预激活表型。(图4)

图4

Smek1杂合性促进巨噬细胞活化

由于小胶质细胞起源于卵黄囊巨噬细胞，而卵黄囊巨噬细胞也可以分化为外周巨噬细胞，研究人员推测Smek1-/+巨噬细胞也参与了神经炎症。他们发现Smek1杂合子外周F4/80+ IL-1β+巨噬细胞比例和脾脏巨噬细胞IL-1β平均荧光强度升高。后续实验表明，Smek1-/+巨噬细胞在“静息”状态下也被预激活，并通过过表达IL-1β促进炎症的发生。(图5)

图5

Smek1通过调节IFN-γ/STAT1轴来维持IDO1

由于髓鞘抗原特异性CD4+ T细胞的激活对MS的发病机制至关重要，研究人员接下来研究了CD4+ T细胞是否与Smek1-/+小鼠EAE的症状加重相关。后续实验表明，与对照组小鼠相比，Smek1-/+小鼠脾脏和淋巴结中CD4+细胞中CD4+ IFN-γ+细胞的比例大大降低，IDO1 mRNA和蛋白水平均下调。表明当Smek1缺失，Th1细胞激活时会下调IFN-γ，从而通过IFN-γ/STAT1轴抑制IDO1的表达。(图6)

图6

IDO1-AhR信号通路的失活会破坏Smek1-/+髓系细胞的免疫抑制

研究人员假设IDO1-AhR通路的下调可能进一步干扰Smek1-/+小鼠免疫抑制的维持，并在EAE过程中诱发明显的炎症反应。为了验证这一假设，研究人员首先鉴定了AhR小胶质细胞的亚细胞位置。IDO1活性降低可能导致AhR核易位功能障碍。通过一些列实验分析结果显示，Th1激活后IFN-γ分泌降低，从而抑制髓系细胞IDO1-AhR免疫抑制级联反应，与Smek1-/+ EAE小鼠临床症状恶化密切相关。（图7）

图7

总结：

本文研究人员用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55 (MOG35-55)免疫C57BL/6小鼠建立EAE模型；免疫后记录临床体征，探讨发病机制；采用免疫染色、定量聚合酶链反应(qPCR)、western blot和酶联免疫吸附法(ELISA)对中枢神经系统组织进行分析；在皮质和海马进行单细胞分析；用流式细胞术、qPCR和western blot检测脾和淋巴结细胞。单细胞测序和体外研究表明，smek1缺陷的小胶质细胞和巨噬细胞在稳定状态下被预激活。smk1 -/+小鼠经MOG35-55免疫后，小胶质细胞和巨噬细胞在高峰期出现过度激活，IL-1β分泌增加。此外，在Smek1-/+ EAE小鼠中，IDO1-AhR通路的功能障碍是由于干扰素γ (IFN-γ)的降低、抗原呈递能力的增强和抗炎过程的抑制所致。这些都表明，Smek1可能是开发MS早期介入治疗的一个可能靶点。

原文链接：https://jneuroinflammation.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12974-021-02193-0

相关阅读

点击下方图片进入云平台资料汇总：

所见即所得，绘图高规格联川云平台，让科研更自由