用户文章|单细胞转录组测序揭示原发性干燥综合症细胞毒性CD4+T细胞扩增及免疫细胞构成

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目的：
原发性干燥综合征(pSS)是一种全身性自身免疫疾病，其发病机制尚不清楚。本研究旨在探讨pSS发病的细胞和分子机制。//
方法：
应用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术，对5例pSS患者和5例健康对照的外周血单核细胞(PBMC)进行单细胞RNA测序，分析pSS发病过程中免疫细胞亚群和易感基因的变化，用流式细胞技术验证scRNA-seq的结果。
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结果：
本研究发现pSS患者中有两个亚群明显增多，其中一个高表达细胞毒性基因被命名为CD4+CTLS细胞毒性T淋巴细胞，另一个高表达T细胞受体(TCR)可变基因被命名为CD4+TRAV13-2+T细胞。流式细胞仪检测结果显示，10例pSS患者外周血T细胞（CD4+GZMB+）总数明显高于10例健康对照组(P=0.008)。pSS患者IL-1 beta巨噬细胞、B细胞TCL1A及大部分细胞亚群干扰素(IFN)反应基因表达水平上调。pSS患者HLA-DRB5、CTLA4、AQP3等易感基因高表达。
背景介绍
pSS是最常见的自身免疫疾病之一，主要影响中老年女性。pSS患者的特点是外分泌腺，特别是唾液腺和泪腺的广泛淋巴细胞浸润，导致口干和眼干。大约30-40%的患者会出现涉及肾、肺、神经系统和其他系统的全身性并发症。近年来，对pSS的研究已经有一定进展，但pSS的发病机制还远未被阐明。B细胞过度激活在pSS的发病机制中起着核心作用，目前对B细胞活化机制的研究已取得一定进展，但具体分子机制尚不清楚。B细胞的关键作用离不开T细胞的参与。细胞类型分析表明，涎腺和泪腺的浸润细胞以CD4 +T细胞和B细胞为主。在疾病早期，浸润的细胞主要是CD4+T细胞。活化的T细胞通过产生促炎细胞因子来诱导B细胞的激活，建立正反馈循环，从而参与疾病的发病机制。以前的研究已经确定的CD4 +T细胞亚群在pSS中的作用。例如，滤泡辅助T细胞(TFH)通过分泌IL-21(白细胞介素21)促进B细胞成熟，pSS患者Th17细胞可能被扩增，辅助自身效应B细胞反应，促进疾病进展。因此，确定主要细胞亚群及其状态对于探索pSS治疗的新方法至关重要。
用流式细胞技术或免疫组织化学(IHC)分析了唾液腺和PBMC中与pSS相关的一些特异性细胞亚群，但这些研究是基于预先选择的细胞类型。最近在高分辨率单细胞RNA测序(scRNA-seq)方面的进展提供了在组织和血液样本中识别与疾病相关的细胞亚群和状态的可性能。通过scRNA-seq可以检测单个细胞的基因表达，可以检测参与疾病发病的特定细胞亚群和细胞类型特异性通路。近年来，scRNA-seq已被用于分析一些自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE)。然而，scRNA-seq在pSS中的应用很少。在这项研究中，本研究收集了5名pSS患者和5名健康对照者的PBMC，进行了scRNA-seq。通过绘制pSS患者的细胞分布图，并将其与循环血细胞进行匹配，以帮助剖析患者之间的疾病异质性，并确定与疾病转归和治疗反应相关的潜在细胞和分子事件。//
结果
来自10个样本的PBMC经过10X平台建库、测序、质控后，共57,288个细胞的进入了后续分析（图1）。主要免疫细胞类型包括T细胞（CD3D+CD3E+），NK细胞（CD3D-CD3E-NKG7+CD247+），B细胞（MS4A1+CD79A+CD79B+），CD14+单核细胞（CD14+SL00A8+SL00A9+），巨噬细胞（CD68+MS4A7+）和DC（CD1C+）。每个样本的免疫组成都有一定程度的差异。

 CD4+和CD8+T细胞的分析（图2）

T细胞可以通过产生细胞因子和效应分子来协调适应性免疫。为了揭示所有T细胞群体的功能亚型，对所有T细胞进行sub分析，共得到8个cluster，包括5个CD4+T细胞(T1-T5)clsuter和3个CD8+T细胞(T6-T8)cluster。与naiveT细胞相关的标记，如CCR7、LTB和SELL，在T1中高表达。T2为高表达CXCR4、TNFRSF4和CCR6的效应记忆CD4+T细胞(TEM)，该cluster与T4、T5在pSS患者的CD4+T细胞组成中特异性扩增。细胞毒相关基因(GZMH、GZMA和GZMB)在T4中高表达，定义为CD4+CTL。为了验证这一发现，本研究选择其中一种细胞毒基因进行了流式细胞分选，结果表明，pSS患者外周血中CD4+GZMB+T细胞明显增多，且pSS患者CD4+T细胞中CD4+GZMB+T细胞的比例明显高于健康对照组(P<0.001)。TRAV13-2和TRBV7-9的T细胞受体α和β链可变基因在T5中富集，T细胞受体(TCR)基因的这种多态性可以决定非致病应答的发生。T6为naive CD8+T细胞，高表达CCR7、LEF1和CD27。T7高表达细胞毒基因，包括GZMH、GZMB和ZNF683，应为激活的CD8+CTL类型。第三组CD8+T细胞高表达SLC4A10、KLRB1和ZBTB16，是一种粘膜相关不变T细胞(MAIT)。 B细胞亚群分析（图3）
以往的研究已经探索了pSS患者的唾液腺和外周血液中的B细胞亚群，一项研究发现pSS患者的浆母细胞和记忆性B细胞数量增加。对3912个B细胞sub分析得到7个不同的cluster，并鉴定出4个cluster，包括幼稚B细胞(B1)、记忆B细胞(B2)、浆细胞样树突细胞(B5)和浆细胞(B6)。B1表达幼稚B细胞相关基因(CXCR4、CD83和IGHD)，CD27在B2和B6表达，B2类归为记忆B细胞，B6高表达免疫球蛋白基因(IGHA1、IGHG1和IGLC2)，归为浆细胞。B5表达CLEC4C、GZMB、PTPRS和IL3RA，与PDC细胞表型相似。B3、B4和B7主要表达IGLV/IGHV和Ig，这些免疫球蛋白基因作为B细胞受体(BCR)与特定抗原结合，促进B淋巴细胞的克隆性增殖和分化，与疾病活动性和自身抗体的产生有关。TCL1A是一种癌基因，与疾病的活动性和自身抗体的产生有关。TCL1A在淋巴细胞白血病(B-CLL)和大多数淋巴瘤中表达失控，涉及多条信号通路，如PI3K和NF-kB通路。在本研究中，TCLIA在大多数B细胞中广泛表达。与HCS相比，pSS患者的多个B细胞亚群中TCL1A的表达显著上调。为了确定TCL1A在B细胞中的表达，进行了RT-qPCR，结果表明pSS患者TCL1A的表达水平高于健康对照组(P=0.0095，图3)。

 pSS患者细胞亚型的差异表达基因(上调)分析（图4）

对每个cluster的差异表达基因进行分析，并选择了pSS中上调的基因(log2Fc≥0.36和P值≤0.01)。发现了几个已知基因和预期基因。首先，一系列干扰素基因在大多数细胞亚群中上调，包括IFI6、IFI16和IFI44L；干扰素诱导的跨膜蛋白IFITM1、IFITM2和IFITM3；以及干扰素刺激基因ISG15和ISG20。细胞因子(IL-32和IL-16)和趋化因子(CCL4、CCL5和CX3CR1)水平也升高。CXorf21是系统性红斑狼疮的易感基因，C11orf31和C1orf162在T、B细胞亚型和单核细胞中广泛表达，TMEM176A和TMEM176B被认为在慢性脊髓损伤中抑制DC成熟。TMEM176A和TMEM176B在3种单核细胞亚型中表达。GWASs测序发现，大多数MHC区域的遗传位点，如HLA-DQB1、HLA-DRA1、HLA-DQA1与pSS相关。此外，HLA-DPA1、HLA-DPB1(T细胞)和HLA-DRB1(T细胞和NK细胞)在T细胞中表达，其中HLA-DRB5基因在每种细胞类型的pSS中表达最显著，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)(Th17)、PDCD6和AQP3也被检测到。综上所述，本研究不仅证实了先前报道的与pSS相关的基因，而且还发现了不同细胞类型的其他特征标记。

 疾病相关通路研究揭示原发性干燥综合征患者的特征

为了分析患者中是否存在细胞亚群特异性通路，本研究对患者中上调的基因进行GO富集分析。干扰素抗原是几种自身免疫性疾病的典型特征，如SLE、pSS、ANDRA等，积极参与炎症反应。在这项研究中，也证实了这种联系。在大多数细胞中，I型干扰素(主要是IFNa和IFNb)和II型干扰素(IFNG)信号被激活，干扰素相关基因，包括IFITM3、IFITM2、IFITM1和XAF1在I型和II型之间有显著重叠。肿瘤坏死因子(TNF)家族信号和抗原处理和提呈途径上调。细胞亚群特异性途径，如TMEM176A和TMEM176B对DC分化的负调控，以及TMEM176A和TMEM176B对DC分化的负调控单核细胞。本研究还进行KEGG富集分析，发现几条免疫相关途径，如凋亡、吞噬和氧化磷酸化被激活。Th1、Th2和Th17细胞分化信号通路在T细胞中富集，并受IL2RG、IL4R和HLA-DRB5的调节，表明Th1、Th2和Th17细胞参与了pSS。这一分析确定了几条上调的免疫相关通路，有助于理解疾病的发病机制。因此，靶向通路可能是治疗pSS的一种有效的治疗策略。
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讨论

本研究应用scRNA-Seq技术对pSS患者和健康对照的PBMC样本进行研究，揭示了pSS患者免疫细胞群体的复杂性，说明pSS患者的免疫细胞群存在较大的变异。本分析集中在T细胞和B细胞上，发现了主要的细胞群和疾病特异性亚群，然后确定了与疾病相关的几个特征和基本的炎症途径。

本研究建立了T细胞群体的详细概述，鉴定出五个CD4+cluster三个CD8+T细胞亚群。发现两个CD4+T细胞亚群，即CD4+CTL和TCR可变基因CD4+T细胞，在pSS患者中特异性扩增。在CD4+CTL亚群中，有几种与CD8+T淋巴细胞的细胞毒功能相关的转录本的特异性扩增，如GNLY、GZMB和NKG7。传统认为，CD8+CTL的作用是利用细胞毒分子清除靶细胞，而CD4 T细胞(通常称为辅助T细胞)的功能是通过各种细胞因子调节免疫应答。

然而，近年来，CD4+CTL的存在已被报道在各种疾病中，CD4+CTL不仅在感染包括人类免疫缺陷病毒(HIV)和巨细胞病毒(CMV)在内的病毒时被观察到，而且在一些自身免疫性疾病中也有发现，如RA、IgG4相关疾病和系统性硬化症。

此外，在一些自身免疫性疾病中，如RA和肉芽肿病合并多血管炎，研究揭示了CD4+CTL的扩张与CMV感染的相关性，表明CMV感染可能在CD4+CTL介导的损伤中起作用。此外，作者还考虑到自身免疫性疾病患者对感染的易感性增加，在本研究中，scRNA-Seq测定的pSS中CD4+CTL的占有率明显高于健康对照组，但pSS组患者年龄高于健康对照组。为了解决这个问题，本研究对年龄匹配的对照组进行了验证实验，FACS结果与scRNA-seq结果一致。作者还研究了CD4+CTL百分率和一些临床指标之间的相关性，但没有发现明显的相关性。

综上所述，CD4+CTL亚群可能在自身免疫性疾病的炎症过程中起重要作用。B细胞通过B细胞的过度激活在pSS的发病机制中起核心作用，而通过删除B细胞或抑制B细胞的信号以损害B细胞的激活和分化的治疗策略已经取得了一定的进展。

本发现提供了通过单细胞转录分析建立的B细胞的详细图谱，包括幼稚B细胞、记忆B细胞和浆细胞，这可能有助于B细胞亚群的靶向治疗。与B细胞亚群相关的IGLV/IGHV基因也被发现，这些免疫球蛋白参与抗原的鉴定，共同决定BCR的抗原特异性，这需要额外的BCR谱系分析。

在pSS患者中，B细胞过度活跃也会增加患B细胞淋巴瘤的风险，是正常人的15-20倍，pSS相关的淋巴瘤多为低度恶性B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在中国，pSS患者患NHL的风险是健康人的48.1倍。一项研究证实了TCL1A在NHL中的表达增加。scRNA-seq和RT-qPCR结果也显示TCL1A在B细胞中表达显著上调，提示本研究中的pSS患者存在NHL的潜在风险。然而，TCL1A在pSS中的研究很少，需要进一步研究TCL1A在该病中的作用机制，一些全基因组关联研究(GWASs)已经建立了pSS与易感基因之间的关联。

本研究观察到干扰素、细胞因子和趋化因子的表达上调，几个潜在的信号，尽管对pSS的注释很差，如CTLA4，它通过竞争性抑制共同配体B7(CD80/CD86)与CD28的结合而对T细胞产生抑制作用。用抗体封闭CTLA4的治疗方法已被用于许多癌症类型，并显示出前所未有的有效性。Abatacept(一种CTLA4激动剂)已被批准用于治疗类风湿性关节炎，并被证明是有效的。

先前的研究表明，pSS中负调控分子PD-1和CTLA-4的表达显著增加。在本研究中，CTLA4在pSS患者的Th17细胞中有独特的表达，其可能的机制值得进一步探讨。以前有报道称水运动与外分泌有关，水通道蛋白(AQPs)可能导致外分泌腺的液体分泌。AQP5已被证明在唾液分泌过程中起着重要作用。在本研究中，AQP3的上调被认为是pSS的标志，并可能在pSS中起到潜在的作用。探索易感基因是开发疾病状态特异性治疗新靶点的迫切需要。据报道，产生IFN的先天免疫细胞在系统自身免疫中起着至关重要的作用，I型IFN主要产生于树突状细胞(DC)。在pSS患者的小唾液腺活检组织中检测到激活的pDC。与以前的报道一致，本研究还在多种类型的PBMC中发现了激活的I型干扰素信号通路。

此外，II型干扰素信号通路也被激活，本研究可为针对干扰素的靶向治疗提供参考。本研究还检测了pSS中的Th1、Th2和Th17细胞分化信号，它们可以导致获得性免疫的激活。

先前的研究表明，Th1和Th17细胞在SS的初始阶段起作用，而Th2和TFH细胞在疾病进展中起主导作用，提示Th细胞参与了pSS的发病。虽然在本研究中，有限的样本量和疾病表现的多样性阻碍了患者的亚群划分，但数据证实了scRNA-seq是可行的，并且提供了大量的数据，这表现出显著的复杂性。单细胞测序技术的应用不仅确定了主要的细胞群体和新的细胞亚群，而且还揭示了与疾病相关的分子特征，从而为治疗策略提供了新的见解。

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