用户文章 | 10分+：多组织单细胞图谱揭示奶牛营养吸收和代谢关键细胞功能 | 单细胞专题

期刊名称:  Journal of Advanced Research

影响因子：10.479

发表时间：2022年3月

发表单位：浙大动科院孙会增课题组

所用组学：单细胞转录组测序

写在正文之前：

小编有话要讲：生命科学和医学又迎来了一个春天，以单细胞技术以及空间组学技术为代表的科学技术，让我们能够对器官结构有新的认知，对人类疾病有新的定义，对胚胎发育有新的了解。随着单细胞技术的广泛应用，基础生信分析概念的科普也越来越重要。我们在完美的阐释数据的生物学意义的同时，还是会想打破生信分析的技术壁垒，全面的去了解这个神秘的ta。

今天，小编就是以一个生信人的身份去解读一篇单细胞文献，我尽量将故事讲的生动点，毕竟我们的宗旨是和大家一起成长，也欢迎大家留言，我们技术工程师看到技术问题，会以“热心观众”的身份回复的哦。

言归正传，正文主要分为两个部分，前面一部分是技术的讲解，后面一部分就是课题相关的研究成果展示，如果您想系统的了解一下技术流程，看part1即可，如果您想了解荷斯坦奶牛消化系统的相关单细胞研究，可以直接跳至part2。

part1

一. 数据处理使⽤的⼯具介绍

文献中老师对生信分析的介绍，非常严谨且系统，笔者如果没有扎实的⽣信功底，那他肯定也是花了很多功夫去学习和了解⽣信知识的。他所介绍的内容包括：

a. 单细胞上机所⽤的试剂盒及版本以及分析所⽤的仪器及型号

b. 数据初步处理所⽤的软件CellRanger及版本

c. 对于数据的处理，下当前流程的趋势就是在初步处理完之后，再使⽤R或者Python中的分析包或者脚本进⾏进⼀步处理，分析，本文中作者采⽤的是的R语⾔中的Seurat包进⾏进⼀步的分析。

d. 进⼀步的分析中，笔者详细介绍了单细胞数据分析中的R包，有点点遗憾的是，笔者没有进⾏每个R包功能以及参数的详尽描述，不过，这个部分确实没有必要哈，因为我们更关注的是⽣命科学探究的问题本⾝，可不能跑偏。按照分析的流程，用到的是一下R包：

DoubletFinder （去除多细胞）

RunHarmony（去除批次效应）

NormalizeData（均一化处理）

FindVariableGenes（计算高度变化的基因）和ScaleData（在FindVariableGenes的基础上进行高表达量的成分的去除）

RunPCA（利用前面计算出的高变gene进行主成分计算）和PCElbowPlot（主成分碎石图）（基于此可以判断样本的批次效应强烈程度）

FindAllMarkers（差异分析）

二. 单细胞数据高级分析

在生命科学的研究中，实验方法这个部分是能够实现全球通用的，但随着生信技术的发展，对研究团队的能力要求会更高，在参差不齐的研究现状中，审稿人对这个跨领域研究课题也是相当的包容，这也是为了促进科学进步的一大动力。

为什么会扯一下题外话呢，因为这篇文章正好处于我们单细胞研究的一个新阶段，并且笔者也非常配合这个新阶段的“游戏规则”，为我们展现了一篇优质的单细胞文章。要知道，即使在生物信息学发展势头如火如荼的今天，一篇优质的文章的核心点还是在于他的生物学意义。本着这个宗旨，笔者在“**Material and methods**”这个部分花了很大的功夫将数据**进行了生物学身份的认证**，这点，我觉得就是研究者能力和魄力的一种体现。

1. 笔者在生物研究的基础上，基于gene不同表达量数据，对细胞进行一个划分（分类），交代了后续研究中的规则；

2. 对于周期gene的处理，笔者是作为常规流程放进去的，没有做过多处理；

3. 富集分析的探讨，笔者也非常严谨，详细交代参考的数据集和使用方法GO富集分析和GSEA富集分析，但是这种做法是有点风险的，毕竟任何参考的数据集都有局限性。

4. 关于拟时序分析，这里用的是monocle3软件，也是目前monocle最新的版本。

5. 关于代谢通路的分析，文章中采用的是Single-Cell-Metabolic-Landscape，这个流程中配置了一个计算通路activities的脚本，但是参考的通路也是来源于KEGG代谢通路，最后基于组织上皮细胞的异质性，使用pheatmap绘制了聚类热图。

6. 互作分析，本文使用基于配受体关系进行互作分析的，所使用的R包叫cellcall，这款包很实用，不仅能体现细胞间的配受体关系（丰度），还能体现转录因子在配受体关系对中的作用，由于这个分析结果信息量特别大，且数据关联分析（转录因子和配受体）的结果有待考证，基于分组间的对比结果可能会更容易获得更有效的结论。

7. 笔者利用两个参考gene集：“单羧酸转运”和“唾液分泌”，并在以细胞类型为分析单元，使用AddModuleScore 这个R包进行细胞类型的打分，这个方法的可信度有待商榷，大致原理就是：在分析单元内部，**随机**抽取gene作为背景gene集，计算表达量的平均值ctl_ave，然后将我们提供的 gene集进行表达量的计算，得到的平均值provide_ave，最后将provide_ave减去ctl_ave即可得到“评分”。最终结果进行了秩和检验。如果进行gene集评分的话，还有另外一种分析方式也可以尝试，即：Single_Cell Signature Explorer， 这个流程中的基因集打分的方式，是基于gene的count值来进行“打分”的。

Part2

一．组织来源： 六头荷斯坦奶⽜（six Holstein dairy cows）

这篇⽂献的特⾊之⼀，就是对⽅法和材料的描述。从每个组织⼤⼩、孵育温度，处理时间以及试剂盒和实验试剂的使⽤，到后⾯的数据处理软件以及R包，甚⾄版本都有标注，这不仅能指导常规的单细胞分析的项⽬操作，也为论⽂的撰写提供了⼀个很优质的参考模 板。(●'◡'●)

二． 关于课题的发现

a. 上⽪细胞与营养转运相关 并且区分了优先吸收不同营养的上⽪细胞亚型；

b. T helper type17细胞在前胃中富集，⽽且主要和⼀类上⽪细胞亚型互作，这个上⽪细胞亚型与IL-17介导的短链脂肪酸的⾼潜在吸收能⼒（high potential uptake capacities） 相关；

c. IL17RA和IL17RC⾼表达（expression levels both greater than 0.25）的上⽪细胞细胞与其他细胞的⽐较，揭⽰Th17细胞在调整上⽪细胞在前胃中起的营养吸收功能。

优势：帮助我们更好地了解反刍动物，以及为提⾼奶⽜以及相关产品的产量和质量提供了新途径。

三．课题研究成果细节

a. 构建单细胞图谱

⽂中详细交代了全图谱中每个组织的所提供的细胞数，以及鉴定到的55种细胞类型。更深⼊进⾏了免疫细胞和上⽪细胞的组织间异质性探讨

b. 分组织类型的探究

基于每个组织类型，本课题进⾏了组织内部的整体降维分析，⽂中直接上了分析结果，在瘤胃、⽹胃和重瓣胃组织的细胞类型鉴定中，发现瘤胃中custer10，14和19 与⽹胃中cluster6，以及重瓣胃中的cluster15均⾼表达GJA1基因。这个基因编码⼀种缝隙连接蛋⽩，具体⾏驶物质转运功能。重点来了，KRT6A和GJA1的免疫荧光检测也进⼀步证实了⽹状和瓣胃组织中存在通道间隙样棘状细胞。

因为瘤胃上⽪细胞的更新速度⾮常的快，位于基底层的肝细胞数量通常没有被关注到，本课题中⽤KRT14 和 MKI67鉴定到了瘤胃中的上⽪祖细胞样亚群，接下来的免疫光实验也验证了这⼀分析。

在⽹胃和重瓣胃组织中也发现分裂细胞（MCs）。瘤胃中有两种MC亚型MC_1和MC_2， 其中MC_1在细胞分裂相关基因中⾼表达，⽽MC_2在DNA复制相关基因中富集。这说明这两种MCs的主要区别在于细胞周期状态，细胞周期分析也证实了这⼀点。我们观察到，⼏乎所有的上⽪细胞类型在瘤胃，⽹和瓣胃可以清楚地区分其转录因⼦组合集。我们观察到这三种组织的MCs均⾼表达转录因⼦HMGB2、CENPS和CTCF。

c. 接下来有个⾮常新颖的探究，课题聚焦于外周⾎和乳腺组织中的中性粒细胞(TGM3和CXCR1的⾼表达)，并通过pseudotime analysis确定了它们在从外周⾎向乳腺迁移过程中，对⾎管发育、上⽪管形成和类固醇激素的反应的影响，确定了中性粒细胞“完成了”重要的⾮免疫相关的任务。

d. 不同组织中上⽪细胞的代谢

上⽪细胞亚型中显著上调的代谢途径可以根据KEGG分类分为10类，这些KEGG分类反映了细胞代谢的不同⽅⾯，如氨基酸代谢、碳⽔化合物代谢和脂质代谢。在前胃组织中， 与其他细胞类型相⽐，基底细胞和棘细胞亚型的代谢通路上调最多，⽽颗粒细胞⼤多数亚型的代谢通路没有明显上调。在回肠和直肠中，Paneth细胞类型的代谢途径上调数量最多。与外源性⽣物降解和代谢以及聚糖⽣物合成和代谢相关的途径主要富集在四腔胃和肠道细胞亚型中。该部分分析总的结果表明，每个上⽪细胞亚型可能在⽜中发挥独特的代谢功能。

e. 溶质载体基因跨组织的细胞类型特异性表达

⼈们对每种细胞类型的作⽤以及它们在营养吸收中的相互作⽤所知甚少。由于短链脂肪酸是反刍动物的主要能量来源，本课题⾸先分析了与肝细胞和上⽪细胞中短链脂肪酸吸收相

关的溶质载体(SLC)基因的表达。SLC16A1被证实在SCFA摄取中发挥作⽤，它在特定的细胞类型中⾼度表达，包括瘤胃中cg样SC_1、cg样SC_2、BC_2和SC_2；⽹胃中MC、BC_1和cg样SC；重瓣胃的MC、BC和SC_1；皱胃的neck cell_1和neck cell_2；在回肠和直肠和CCK +肠上⽪细胞。其他SLC16A家族基因也cell-type-specifically表达。例如， 刍胃中neck cell_2，回肠中entero_ endocrine细胞，直肠的杯状细胞，肝脏的胆管，涎腺基底和KLK1+导管细胞亚型，乳腺管腔细胞_1亚型表达SLC16A1；瘤胃MC_1表达

SLC16A9；回肠LYSB+和CLCA1+杯状细胞亚型表达SLC16A7。

另⼀种可能也是更重要的短链脂肪酸吸收机制是短链脂肪酸通过反向转运体与碳酸氢盐和其他离⼦交换，尽管这种转运体尚未被确定。包括SLC4A、SLC26A、SLC21A和SLC22A家族成员在内的编码阴离⼦交换体的SLC基因可以被认为是SCFA摄取转运蛋⽩的候选基因。由于氯离⼦从粘膜侧消失与SCFAs的摄取呈负相关，我们也关注了与氯离⼦跨膜运输相关的SLC12A家族。这些家族中的基因具有⾼度的细胞型特异性。有趣的是，SLC4A和SLC12家族的成员在上述SLC16A家族基因⾼表达的细胞亚型中富集。例如，SLC4A9，最可能编码反向转运蛋⽩，推测参与脂肪酸跨膜转运，SLC12A7均在瘤胃cg样SC_2和⽹胃cg样SC中⾼表达，SLC4A4和SLC12A2均在瓣胃SC_1中⾼表达。

本研究中，与糖运输相关的SLC基因，如SLC2A和SLC45A家族的基因，在⼏乎所有前胃组织上⽪细胞亚型中都不富集，但在其他组织的特定细胞亚型中富集。这与现有的知识是⼀致的，即前胃上⽪细胞仅摄取少量的葡萄糖，不到代谢能摄⼊量的0.1%。产糖前体， 尤其是丙酸，会引起糖异⽣以满⾜奶⽜肝脏产糖的需要。我们发现肝细胞特有的⾼表达SLC2A3，这表明该基因在肝脏分泌葡萄糖中起重要作⽤。课题还注意到参与氨基酸转运的SLC基因在乳腺上⽪细胞亚型中有差异表达。同时鉴定了轻链氨基酸转运蛋⽩SLC3A2、中性氨基酸转运蛋⽩SLC38A2和阳离⼦氨基酸转运蛋⽩SLC7A4分别在luminal cell_1、luminal cell_2和luminal cell_3中表达。与基因表达相对应的是，在不同的组织中也观察到细胞类型丰富的功能。例如，GSEA显⽰瘤胃的cg样SC_2，⽹胃的cg样SC，瓣胃的SC_1,可能具有较⾼的SCFA吸收潜⼒。基因集评分分析还确定了沿胃肠道具有⾼单羧酸转运评分的上⽪细胞亚型，唾液在促进SCFA吸收⽅⾯发挥着重要作⽤，唾液腺上⽪细胞亚型在唾液分泌⽅⾯存在显著差异。总的来说，研究发现了SLC基因编码的转运蛋⽩特异性表达的细胞亚型，这些转运蛋⽩与奶⽜各被检测组织中营养物质的分泌和吸收能⼒有关。

f. Th17细胞与前胃上⽪细胞转运功能的关系

通过分析各组织中主要免疫细胞类型的分布，我们发现Th17细胞(⾼度表达CD4和IL17A) 是瘤胃、⽹胃和重瓣胃特异性细胞类型，占这三种组织中总免疫细胞的⼤多数。通过荧光原位杂交进⼀步确认Th17细胞。根据Th17细胞的功能可塑性，Th17细胞分为稳态Th17 细胞和炎性致病性Th17细胞。稳态Th17细胞通常驻留在粘膜表⾯发挥其作⽤[37]，⽽炎症性、致病性Th17细胞则需要IL23R[36]的表达。Th17细胞很少表达IL23R或促炎基因， 说明Th17细胞在前胃组织中处于稳态状态。

接下来，课题使⽤CellChat构建细胞间通信⽹络，以揭⽰瘤胃、⽹胃和重瓣胃中的细胞相互作⽤。有趣的是，Th17细胞主要通过IL-17信号通路与上述三种前胃组织中具有SCFA摄取潜能的上⽪细胞亚型相互作⽤。值得注意的是，在所有已知的配体-受体对中， IL-17在瘤胃、⽹胃和重瓣胃中的信号转导归因于IL17F和IL17A配体及其多聚体IL17RA/IL17RC受体。

 

⼤总结

总的来说，本课题构建了泌乳奶⽜关键代谢组织的单细胞转录组图谱，为揭⽰不同组织在单细胞分辨率下的不同基因表达模式提供了有价值的资源。重要的是，确定的细胞间通信信号通路是营养物质运输的关键。这些发现将有助于改善动物健康和⽣产制定精确的⽬标，时刻践⾏⼈和⾃然和谐相处的理念。

解读完这篇⽂献，我感触颇深。因为⽂章就像⼀棵参天⼤树，展⽰的那是繁枝⾼拂九霄 霜，让⼈不禁连连赞叹，但，这背后需要的是渊博的⽣命科学知识储备和强⼤的⽣信分析能⼒，凝结的是科研⼯作者艰⾟的探究和不辞⾟苦的信息挖掘，最重要的是熬过⽆数个⽆⼈知晓的孤寂瞬间，只为这⼀颗种⼦能够落地⽣根，⻓成这枝⼲挺秀的模样。

关于联川生物杭州联川生物为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、蛋白组、代谢组及最新的单细胞测序服务。单细胞测序作为联川战略发展方向，在组织解离和单细胞生信分析方面充分发挥自身优势，为客户提供优质的服务。目前已经与100多个国家及地区的科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系，累计发表单细胞测序相关的SCI论文近50篇，影响因子平均15+。

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