用户文章 | 单细胞RNA测序分析大鼠耳蜗发育过程中大上皮嵴细胞变性

发表杂志：Frontiers in cell and developmental biology

影响因子：6.684

发表时间：2021.10

发表单位：上海交通大学医学院附属新华医院 耳鼻喉头颈外科

前言摘要：

大上皮嵴细胞(GER)是耳蜗管中一种短暂的新生细胞群，在毛细胞功能成熟、顶盖膜结构发育和听前听觉定位的细化中起着至关重要的作用。大上皮嵴细胞是否存在不同的细胞亚型以及出生后耳蜗发育过程中的退变机制尚不清楚。在该研究中，对出生后第1天(P1)和第7天(P7)的大鼠耳蜗管进行单细胞RNA测序，以确定大上皮嵴细胞亚群和发育过程，为进一步了解大鼠耳蜗发育过程中大上皮嵴细胞的变性提供参考依据。

1.研究方法

1.1取样

出生后第1天(P1)和第7天(P7)的大鼠耳蜗管。

1.2测序

组织解离制备单细胞后，利用LC-Bio Illumina NovaSeq 6000测序系统(150 bp双端测序)对文库进行测序。

图1A P1和P7耳蜗导管制备，单细胞分离，Chromium10x文库制备和测序

2.结果与分析

利用cellranger对细胞进行捕获，过滤后一共得到25139个高质量细胞。首先对数据的测序质量做了总结，包括高质量reads，细胞平均reads数，细胞基因中位数等等，采用Seurat包进行tSNE进行降维聚类，一共得到26个cluster（图1B,C），对每个cluster高表达的基因做了热图和tSNE图展示（图1D,图2）。

图1B,C P1,P7耳蜗细胞的tSNE图，不同颜色表示不同cluster

图1D P1和P7 2样本各个cluster top5基因热图

图2 P1和P7耳蜗细胞中每个cluster中最高表达基因的tSNE特征图

2.1 GER细胞的鉴定

大上皮嵴细胞在耳蜗发育过程中是一种短暂的结构，其典型表现是在听觉发育过程中细胞数量逐渐减少。对P1和P7的cluster细胞数量进行比较分析发现，有4个cluster（clusters 0, 3, 4和6）细胞数量在P7中显著减少，作者将这些细胞注释为GER细胞，对这些GER细胞簇进行了基因型分析。图4点图展示了这些cluster中top5高表达的基因，进一步地对其中部分差异表达的基因进行小提琴图的展示（图5），介绍了这些基因在各个细胞数量显著减少的cluster中的表达情况。

图4 cluster0,3,4和6中top5高表达基因的点图（点的大小代表各个cluster中细胞表达目的基因的比例，点的颜色代表所有细胞中目的基因的平均表达）

图5 在cluster0,3,4,6和8中差异表达的基因的小提琴图

纵坐标表示表达水平，横坐标表示cluster，小提琴宽度表示在该表达水平上的细胞数，细胞越多越宽

2.2 GER细胞簇的GO和KEGG功能性分析揭示细胞簇之间的相似的表达模式

GO富集分析分为分子功能（Molecular Function）、生物过程（Biological Process）、和细胞组成（Cellular Component）三个部分。KEGG通路富集分析常常应用于差异表达基因的功能注释，了解差异表达基因的相关功能与作用通路。作者分析了这些cluster的GO（图6）和KEGG（图7）富集情况。GER簇在Go功能富集方面有很多共性，从生物学过程来看，RNA聚合酶II在翻译和转录负调控方面的富集更为一致；在细胞成分方面，基因富集在细胞核和细胞质中更为一致；在分子功能方面，主要富集在蛋白质结合和核糖体的结构成分上。同时，不同的GER细胞簇，如cluster3和cluster4，有大量基因富集于RNA聚合酶II的转录负调控中，发挥负动态调控作用，这些负调控基因主要是Nedd4, Rarb, Foxp2, Pawr, Dact1, Igf2, Egr1, H2afy2, Btg2, Calr, Foxc1, Mdfi, Rps14,Jun, Peg3 and Ets2。目前已证实有几个基因和信号通路在内耳发育中发挥重要作用，如 Sox2, Pax2, Atoh1, FGF,Notch, FoxG1 , Shh, mTOR 以及 Wnt通路。

基于KEGG信号通路的结果显示，这4个GER细胞簇的基因富集具有高度的一致性。cluster0,4和6显著富集在核糖体信号通路中，cluster 3除富集于核糖体信号通路外，还富集于PI3K-Akt和蛋白消化吸收信号通路，与GO功能分析结果一致。

图6 GER 细胞簇的GO富集分析

图7 GER 细胞簇的KEGG富集分析

纵坐标表示KEGG通路，横坐标表示富集因子，点的颜色代表富集到该通路的显著性情况，颜色越红表示越显著

2.3 GER细胞簇的荧光原位杂交(FISH)

为了验证cluster 0,3,4和6的细胞类型特异性基因，作者使用荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)在耳蜗P1到P7的横截面上定位这四种类型的GER细胞的转录本。根据scRNA-seq结果，选择在cluster 0,3,4和6上高表达的4个基因用于FISH: Otor、Col6a1、Scara3和Ccn3。与scRNA-seq结果一致，Otor在P1整个GER细胞中高表达，在P7中表达下调(图12A,E)。Col6a1在P1处的耳蜗EGR区显著表达，但在P7处几乎消失(图12B,F)。Scara3在P1期集中表达于耳蜗GER区侧壁，在P7期分散表达且明显减少(图12C,G)。在P1时，Ccn3在耳蜗GER区表达的位置与Otor有很多重叠，但在P7时，Ccn3的表达也明显降低(图12D,H)。

图12 高表达基因Otor、Col6a1、Scara3和Ccn3在GER细胞簇的荧光原位杂交验证

3.讨论

在该研究中，作者比较了P1和P7两个不同时期样本的细胞簇类型和细胞数量，发现cluster0,3,4和6细胞数随着时间的增加而减少，定义为GER细胞簇，GER细胞簇有着相似的表达模式，KEGG富集分析表明GER细胞簇主要在核糖体信号通路以及PI3K-Akt信号通路富集，核糖体信号通路是调控发育的重要信号通路，而核糖体的生物合成是整个生物学过程中最具多面性和能量需求的过程之一。有丝分裂是器官发育成熟的关键过程，但在出生后发育过程中GER细胞总数减少，可能主要与cluster 3的负调控信号通路有关。PI3K-Akt信号通路是调控细胞增殖、分化、凋亡和迁移的重要信号通路，在耳蜗发育再生研究中，它也被证明可以调节毛细胞再生。cluster3有大量的基因富集于PI3K-Akt信号通路,包括Col4a2, Col6a2, Creb3l1, AABR07068316.1, Igf2, Col4a1, gf1, Col6a1, Fn1, Pten, Col1a1, Spp1, 这可能调节GER细胞的增殖和凋亡,并通过蛋白消化吸收信号通路上的 Col5a2, Col4a2, Col6a2, Col3a1, Mme, AABR07068316.1, Col5a1, Col4a1, Col6a1, Col1a1调控这些凋亡蛋白和细胞碎片的自噬，从而指导GER细胞的有序变性或可能的毛细胞或支持细胞的转化。作者目前的数据为GER的细胞发育提供了参考，并提出了大鼠出生后发育期间GER变性可能的机制。

参考文献

Chen J, Gao D, Chen J, et al. Single-Cell RNA Sequencing Analysis Reveals Greater Epithelial Ridge Cells Degeneration During Postnatal Development of Cochlea in Rats. Front Cell Dev Biol. 2021;9:719491. Published 2021 Sep 3. doi:10.3389/fcell.2021.719491

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