用户文章｜单细胞RNA测序揭示了猪精子发生的动态过程和新标记

论文标题：Single-cell RNA-sequencing reveals the dynamic process and novel markers in porcine spermatogenesis

刊登日期：2021年12月

发表杂志：Journal of Animal Science and Biotechnology

影响因子：5.032

研究机构：西北农林科技大学动物科学与技术学院、陕西理工大学生物科学与工程学院

1. 猪睾丸组织细胞类群鉴定

将150日龄黑猪猪睾丸组织分离成单细胞并进行10×Genomics scRNA-seq（图1A）。通过t-SNE分析划分了20个簇，结合人的marker，定义了6种已知的细胞类型。分别为：生殖细胞（精原细胞、精母细胞、精子细胞）、体细胞（支持细胞、间质细胞、肌样细胞）（图1B-C）。利用 Metascape进行功能富集分析，进一步分析了猪体细胞和生殖细胞的潜在功能（图1D）。

图1 A-D

2. 通过bulk RNA-seq验证猪生殖细胞类型

使用速度沉降法STA-PUT富集猪精原细胞、精母细胞和精子细胞，并鉴定纯度。成功富集生精类群后，进行bulk RNA-seq以验证scRNA-seq结果。首先通过PCA分析验证了样品的重复性（图3A)。接着通过差异基因分析，在精原细胞和精母细胞之间共鉴定出9919个DEG，其中上调5626个，下调4293个；从精母细胞到精子细胞，上调基因2799个，下调基因4742个；从精原细胞到精子细胞，上调3680个，下调4126个。这与先前在小鼠中的报道一致，蛋白质编码基因的表达在减数分裂过程中不表达，并且成对比较时在精母细胞中下调更多，表明在精母细胞中的转录活性较低（图3B）。

为了探索特定阶段基因的可能功能，使用maSigPro进行时列分析。12556个可变基因被聚为7类，其中，基因表达趋势显示，第1类基因在精原细胞中特异表达，第6类和第7类基因分别与精母细胞和精子细胞相匹配（图3D）。精原细胞、精母细胞和精子细胞中分别有1592、1480和1031个阶段特异性基因。对这些基因进行功能富集分析。精原细胞中上调的基因显著富集于ncRNA代谢途径；精母细胞中的上调基因参与减数分裂细胞周期、PIWI相互作用RNA（piRNA）的生物发生和配子的产生；精子细胞中上调的基因参与单次受精和鞭毛精子运动（图3C）。总之，功能富集结果表明，scRNA-seq鉴定的细胞类型与Bulk RNA-seq鉴定的细胞类型相似。

此外，作者对猪生殖细胞进行了聚类（图3E），并根据从scRNA-seq数据中定义的细胞类型获得的阶段特异性标记基因对RNA-seq和scRNA-seq数据进行了匹配（图3F），验证了所定义的猪生殖细胞类型的准确性。

图2 A-F

3. 猪精原细胞分化过程中的细胞异质性

为了捕捉猪生殖细胞的分化，作者重新聚类了代表精原细胞和减数分裂早期精母细胞的簇15、2、17、11，以分析精原细胞分化和减数分裂的亚群。重新聚类后发现了9个亚群（图4A）。根据UCHL1的表达和少量表达SSC标记基因的细胞，检测到一个与未分化的精原细胞有关的亚群（Un-diff）。根据CD81、PCNA、KIT、STRA8、TSPAN33和DMRT1的表达，有5个亚群被划分为精原细胞分化的3个阶段（Diff-1、Diff-2和Diff-3）。通过参与联会复合体和减数分裂重组的标记基因鉴定出剩余三个亚群：细线期前精母细胞（Pre-Leptotene）、细线期精母细胞（Leptotene）和合子线期精母细胞（Zygotene）。最终获得了精原细胞亚群的细胞类型特征，并揭示了减数分裂的早期阶段（图4B）。标记基因在每种细胞类型中的表达如图4C所示。此外，通过皮尔逊分析对鉴定出的细胞类型的相关性进行了分析，发现有丝分裂和减数分裂之间的相关性很低（图4D）。

接下来，为了研究这些亚群的不同功能，作者进行了富集分析（图4F）。Un-diff的标记基因在前体代谢物的产生以及TP53对能量和转录的调控中显著富集。Diff-1基因在细胞周期、核苷一磷酸代谢过程和RNA的代谢中富集，这与分化的精原细胞正在经历增殖扩张的概念一致。Diff-2基因在真核翻译延伸和翻译起始复合体的形成中富集。Diff-3中的标记基因参与了减数分裂的联会和染色体分离，这表明该阶段的基因随后进入减数分裂。此外，减数分裂进程和配子的发育在前细线期、细线期和合子期的标记基因中显著富集。这些结果表明猪精原细胞亚群中许多生物学过程是活跃的。

为了进一步探索猪未分化和分化精原细胞的细胞类群特异性基因，作者在每个簇中筛选了一系列标记基因，分析了这些基因在精原细胞分化过程中的动态表达变化（图4E）。分析表明，SDC2、PTPRJ、PIANP、NDRG2、CD99和CCND2在Un-Diff中特异表达，RARG、PODXL2、CTCFL和Cdh2在diff-1~3中高表达。

图3 A-F

4. 猪睾丸中 CD99 和 PODXL2 细胞定位的鉴定

为了鉴定新的标记基因，作者对CD99和PODXL2进行了免疫组化染色。免疫组化分析显示CD99和PODXL2定位于曲细精管基底膜附近的精原细胞（图5A）。根据scRNA-seq数据，CD99和PODXL2在不同亚群的猪精原细胞中均有表达。其中，CD99主要在未分化的精原细胞中富集，而PODXL2在分化的精原细胞中优先表达。为验证这一点，作者对CD99/UCHL1和PODXL2/KIT进行了双重免疫荧光染色(图5B、C)。结果表明，CD99+细胞与未分化精原细胞标志物UCHL1部分重叠（96.03%±1.02%），表明CD99+细胞是未分化精原细胞的一个亚群(图5D)。PODXL2和KIT的共存分析表明，大多数PODXL2+细胞也对KIT呈阳性反应，KIT是一种精原分化标志物（82.94%±5.66%），这表明PODXL2标志着猪睾丸的精原分化群体（图5E）。综上所述，CD99和PODXL2可以作为猪精原细胞亚群的可靠marker。

图4 A-E

总结

这项研究分析了猪睾丸的单细胞转录组，鉴定了四个精原细胞亚群、精母细胞、精子细胞和三种体细胞类型，揭示了12个候选精原细胞标记物，确定了未分化和分化精原细胞的新细胞表面标志物。同时，使用bulk RNA-seq，为生殖细胞簇的定义提供了进一步的支持性证据，揭示了猪精子发生的动态过程和新标记。

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