什么样的组织样本可以开展10x Visium空间转录组研究？| 空间转录组专题
近期经常接到销售同事关于空间转录组业务的咨询，下面是一段有代表性的对话：
“你好，我这里xxx老师想用xxx做空间转录组，不知道可不可以做？”
“这个，我也不敢说一定能做，我们可以帮忙试试。”
“怎么试？”
“可以先让老师用OCT包埋新鲜样本，寄给我们，我们帮忙切片染色，老师看到满意的切片，RNA质检合格，我们可以继续往下尝试。”
“那有没有相关的paper？”
“这个组织不太常见，似乎没见过paper。但是没见过paper不代表不能做，发表过类似组织的paper也不能代表这个样本一定能做，对不对？主要还是看样本的状况。”
“哦，好吧。”
销售同事内心OS：跟我打太极是不是？
作为多年实验翻车选手，话不说满是我一贯的风格。毕竟，看上去再完美的实验设计，也有翻车的可能...
以上的对话归结起来，核心的内容便是：怎样的组织样本可以做空间转录组？
我们先按照销售同事的思路，来看看已经发表过哪些物种哪些组织的空间转录组研究论文。
表1 已发表的使用10x Visium平台进行空间转录组研究涉及的物种及组织（不完全统计）
从已经发表的文献来看，组织类型几乎不是障碍，这些已发表的工作可以当做样本可行性的重要参考。对于人和小鼠而言，现有研究几乎涵盖了常见的组织，尤其在癌症研究中，空间转录组已经成为一大利器。因此可以认为，对于大部分的常见动物组织，进行空间转录组研究都是可行的，除了一些极特殊的组织，如液体组织（血液等），软骨组织（较难透化）。对样本的一大限制因素是样本的大小，这是Visium芯片捕获区域决定的（6.5mm x 6.5mm）。即便如此，对于1cm左右大小的样本，依然可以考虑通过分割样本进行切片来解决问题。10x Genomics及其他提供空间组学服务的厂商都将对捕获区域的大小分辨率进行改进，因此可以预见，在未来，更多样本的空间转录组研究将成为可能。
图1 10x genomics预计将在2022年下半年推出的升级版Visium产品Visium HD
那么，组织只要小于捕获区域即可行么？显然也不全是。进行空间转录组研究的出发点首先就是研究对象存在空间异质性，如肿瘤可进一步划分为癌组织与癌旁。对于没有异质性或异质性不强的样本，如流动的组织（骨髓等），即便可以包埋切片，进行空间组学的研究意义也不大。对于厘米级的大小的样本，当前的spot（55μm）分辨率下，大部分组织都可以观察到空间异质性，但如果样本极小（如小于捕获区域的20%），在目前的分辨率下存在无法完全解析空间异质性的风险，因此对于这样的样本，即便单从芯片利用率的角度，也不建议尝试空间转录组分析。理想的切片应至少占捕获区域面积的50%（这样能保证Visium玻片能有效利用）。理论上，如果样本较小，可以尝试在一个捕获区域贴入多片组织。但这种方式操作上难度极大，容易造成不同切片重叠在一起。即便将两个组织块同时包埋，也不能保证在切片时同时获得想要的切面。所以，在决定尝试空间转录组实验时，首先应考虑样本是否具有丰富的空间异质性可供分析，并且尽量保证一个切片对应一个捕获区域。
图2 常见贴片问题
另外需要考虑的因素还有切片的成像。对于大部分组织，传统的H&E染色即可满足大部分成像的需求。10x Visium的官方指南也同时推荐了免疫荧光的方法。结合切片成像结果，可以预先对切片进行注释，对空间异质性或病理学结果进行初步判断，在完成测序后，可以将测序的结果与切片注释进行对照分析。如果不能对切片进行较好的成像，即便后续能够获得足够的数据，因为无法对切片进行初步的注释，在后续数据分析时也可能难以得到理想的结果，除非是一个完全未知的组织，需要通过空间转录组的结果来对组织进行注释。
获得了满意的切片后，还要保证切片中RNA的质量，以保证Visium玻片能充分捕获切片中的mRNA。对于面向新鲜组织冰冻样本的空间转录组，样本质检过程中最重要的指标是RNA的完整性。常见的指标是RIN值。根据10x Genomics的官方指南，当从切片中提取的RNA其RIN值大于7时，可保证较高的实验成功率。同时，冰冻切片样本还包括了组织透化时间摸索这一过程。在一定的时间范围内，利用cy3荧光标记的核苷酸，可以在特定的荧光通道中观察到透化玻片中mRNA反转录产生的荧光信号。RIN值及透化时间两重预实验均获得较好结果，绝大部分情况下，可以保证表达玻片实验获得理想的数据。
综上，空间转录组对于动物组织的样本类型，具有一定的普适性，但需要保证组织的具有足够的有意义的空间异质性，并且在保证样本大小及合适成像的同时保证其RNA质量。已发表的文献可以作为样本参考，若未见文献发表，样本如能保证以上因素同时满足，亦可进行空间转录组分析。
如此看来，样本的制备对于空间转录组实验的成败几乎起到了决定性的作用。近期发表在Clinical and translational medicine 杂志上题为Clinical challenges of tissue preparation for spatial transcriptome的文章，对空间转录组临床样本的制备进行了探讨。研究探讨了H&E切片染色的效果与RIN值的关系。研究发现，患者的病理特征与RIN值和H&E染色得分并没有显著的相关关系。这也侧面说明，经过成像后，即便获得了满意的切片，也需要进一步对切片中的RNA进行RIN值检测，保证其质量。研究还根据样本的采集和处理，对影响空间转录组测序质量的相关因素进行了评估，包括样本采集的位置、采样方法、手术室保存条件、运输和储存、样品运输时间、样品处理方法以及保存条数等。综合这些因素的分析，研究最终得出结论，上述因素需要得到标准化，而这其中样本的分离时间和干燥条件对空间转录组样品的UMI质量至关重要。建议在手术室中样本的临时保存时间不宜超过30min，并在包埋前充分擦净组织液等液体（保持相对干燥状态）。因为在手术室保存超过30min及冷冻保存超过7天时，组织形态质量较差。另外临时保存条件和溶液的变化直接影响组织形态和空间转录组的质量，其中OCT包埋后干冰保存的样本质量比直接冷冻的样本质量更好。这些结论，对非临床样本空间转录组实验亦有指导意义。
图3 临床组织空间转录组样本制备论文
根据上述论文的结论，结合联川生物丰富的空间转录组项目经验，我们推荐各位老师对新鲜组织样本直接OCT包埋并使用干冰冷冻，具体流程如下：
名称 | 厂商 | 货号 | 备注 |
OCT组织包埋液 | Sakura | PN-4583 | 湿冰或4°冰箱预冷≥30min |
组织包埋盒 | 世泰PVC塑料包埋盒 | / | 包埋盒大小：17*17*5mm |
干冰 | / | / | 干冰用研钵和杵敲碎为干冰粉 |
医用手术刀 | / | / | 使用前需干冰预冷≥30min |
医用镊子 | / | / | 使用前需干冰预冷≥30min |
吸水纸 | / | / | / |
表2 空间转录组样本制备所需耗材列表
将新鲜的组织样本分为两份，一份用于抽提 RNA检测样品质量，一份用于冷冻切片进行空间转录组实验。将两份样本分别切成长×宽不超过6.5mm×6.5mm，8mm≤高度≤12mm的组织块（其中6.5mm×6.5mm为切片横截面面积），用实验专用吸水纸擦干表面（防止冰晶的形成）。如样本较难获取，可制备一份样本，但此样本的高度尽量达到12mm，以保证足够用于质检和正式实验。
在组织包埋盒中滴入少量OCT组织包埋液，再将上述修剪好的组织块找好角度放在组织包埋盒中，再加入OCT组织包埋液没过组织块，如下图1。另外，在包埋过程中加入包埋液要避免产生气泡。
注意：包埋时组织的摆放角度十分重要，请将 6.5mm×6.5mm的横切面平行于包埋盒底部进行包埋，关注的切面必须朝上放置。
图4 OCT包埋剂中的组织
将组织包埋盒放在干冰上速冻直至包埋剂变硬变白。根据组织的大小调整速冻时间，一般速冻时间不宜低于10min。
图5 干冰速冻中的包埋组织
包埋后的组织固定到包埋盒中，在包埋盒上标记好样品名称，转入自封袋内标记好，随打印好的样品提交单一起寄出。如暂不送样，先保存在- 80℃冰箱中。
干冰运输：将样品从冻存环境中取出，放入壁厚且质量完好的泡沫盒中，样品的上下和四周都用干冰填满，将泡沫盒子封好后邮寄。24小时内能够到达的，干冰重量不得低于5kg；48小时内能够到达的，干冰重量不得低于10kg；72小时内能够到达的，干冰重量不得低于15kg。
欢迎选择联川生物，选择联川生物的空间转录组服务。
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