空间转录组文献解读|空间蛋白质基因组揭示独特且进化保守的肝巨噬细胞生态位
研究背景与研究目的
单细胞技术的巨大进步使得我们可以在不同物种间更好地理解器官中的细胞组分，这些细胞是如何在不同的微环境中组织的仍然缺乏深入的认知。此外，单个器官中特定的细胞互作是如何决定细胞类型依然有待探讨。对于肝脏，此前在小鼠中已有肝细胞空间组织的相关研究，然而对于其中的非实质肝细胞成分分布至今不甚明晰。在人类肝脏研究中，对肝细胞的类型及空间的精确位置的研究几乎处于空白状态。此外，如何连有效关联转录组数据和蛋白质组学分析也缺乏研究，导致缺乏使用流式细胞仪和共聚显微镜鉴定细胞类型的细胞表面标志物。因此，需要开发一种全新的方法，用以全面鉴定小鼠和人肝脏细胞及它们的准确位置，为深入地鉴定和肝细胞提供一种新的思路。
实验技术
流式细胞分选，共聚焦显微镜，Visium空间转录组，单细胞（核）测序（scRNA-seq、snRNA-seq），Visium highly multiplexed protein（空间组织蛋白多蛋白同时成像）
研究结果
鼠科动物肝脏的蛋白质基因组图谱
对于肝组织，首先比较单细胞转录组（scRNA-seq）和单细胞核转录组（snRNA-seq）两种方法在细胞鉴定上的区别。两种方法在鉴定的细胞数目和基因数目上并没有特别明显的差异明显的差距（scRNA-seq），但是两种方法都鉴定到了独特的高表达细胞类型，且scRNA-seq中的基因表达量相对更高。此外，在不同的细胞类型中，两种方法中可分别鉴定到解离相关和snRNA-seq相关的基因表达。尽管snRNA-seq产生的基因/细胞数量少于scRNA-seq，但它可以更好地观察活体的细胞分布频率。鉴于两种方法各有优势，最理想的方式是根据研究目的决定合适的路线。这项研究寻求建立整个肝细胞的完整蛋白质基因组图谱，因此同时结合了两类数据。
为了在单细胞层面同时解析mRNA和蛋白的表达，研究采用了CITE-seq策略（测序相结合的转录组和抗原表位细胞索引），对部分选定的部分单细胞测序样本用寡偶联抗体进行染色，从而将蛋白质与mRNA数据均考虑在内进行多组学分析。差异表达基因（DEG)和差异蛋白质(DEP)的分析确定了17种细胞类型，并确定了这些细胞类型的表面标志物，如Kupffer细胞（肝内巨噬细胞，KC）的VSIG4和FOLR2。
图1 健康小鼠的肝脏蛋白质基因组图谱
肝区细胞亚群的空间分布
为了定位先前鉴定的细胞位置，研究从两个不同的方向获得了肝脏组织切片，用于空间转录组分析，沿空间轨迹对每个Visium spot排序，利用已知的肝细胞功能分区标记对肝门、门静脉周围、中间区域及肝中央区域进行注释。通过使用上述的单细胞数据，将每个spot解卷积，得到其组成的细胞类型，并研究了不同细胞类型的丰度是如何随分区而变化的。结果表明，胆管细胞主要定位在肝门区域，而KC则位于门静脉周围和中间区域等，初步表明细胞定位的结果是可靠的。
进一步地，研究还鉴定了适合共聚焦显微镜的细胞表面标志物，用于进一步地验证单细胞分辨率下的定位结果。由于适于共聚焦显微镜观察的固定步骤会影响不同表位的完整性，导致无法预测哪些抗体可以在固定的组织切片上起作用，因此进行了第二轮的Visium分析，补充了根据CITE-seq筛选的100种寡偶联抗体，用以筛选适用于共聚焦显微镜的抗体。这种方法对大部分细胞类群都筛选到了适宜的抗体。基于单细胞数据选择了部分差异表达基因，并进行了空间解析。使用胆管细胞基因和已知的该分区肝细胞标记基因，确定了该数据集中的肝门-肝中心区的细胞轨迹。使用相关标记基因，将鉴定到到树突细胞定位至门静脉。结合蛋白质表面标记和巨噬细胞到特异性mRNA表达，证实了非KC巨噬细胞的存在。
图2 健康小鼠胆管周围的巨噬细胞群
骨髓细胞的精细分析鉴定了肝巨噬细胞的三个亚群
为了深入了解这些非KC巨噬细胞，在单细胞数据分析定义的11个细胞群体结果中对骨髓细胞进行了再分群，包括了KC细胞，三个非KC细胞，以及过渡单核细胞（介于单核细胞与巨噬细胞之间对一种细胞类型）。对非KC巨噬细胞的分析发现，cluster6为覆膜巨噬细胞，基于其他类群间的DEG分析表明cluster7也可能类似覆膜巨噬细胞，而cluster8类似于在脂肪肝相关研究中描述的Gpnmb+Spp1+脂质相关巨噬细胞（LAMs）。CITE-seq获得的标记基因无法完全区分cluster7和cluster8，根据标记CD207的丰度，可将非KC细胞区分为CD207+和CD207-巨噬细胞，若对肝覆膜进行解剖，能观察到CD207+的相对丰度增加。分子细胞图谱证实了肝覆膜中存在CD207+巨噬细胞，同时揭示了中央静脉的CD207+巨噬细胞，而门静脉中则很少发现这种巨噬细胞。因此cluster7由覆膜和中央静脉的CD207+局势细胞。以上的分析表明，需要进一步利用空间方法来确认细胞类型。分子图谱还在门静脉和中央静脉处鉴定到了表达Ccr2和Chil3的巨噬细胞，类似于cluster11中的过渡性单核细胞。最后，还发现了一群表达Gpnmb的巨噬细胞专门位于胆管周围。由于Gpnmb表达是cluster8特异的，并且这些细胞类似于LAM，将这些细胞定义为胆管LAM。GO分析表明，KCs的功能主要体现在体液调节上，而LAM则更广泛地与免疫反应相关。
图3 不同生态位下的巨噬细胞亚群
巨噬细胞亚群分布于不同的空间生态位
先前的研究以及研究中的单细胞数据均表明所有巨噬细胞群都与其局部环境中的CD45-细胞密切接触，因此对CD45-细胞进行了分析，确定了内皮细胞（EC）和基质细胞（SC）的多个亚群。EC可以进一步地细分为4个不同的cluster，对这些cluster 的位置分析可以将这些cluster进一步定义为中央静脉EC（cluster10，肝窦内皮细胞EC（LSEC， cluster9）、门静脉EC（cluster11）和淋巴EC（LEC, cluster12）。空间分析在门静脉和中央静脉中都发现了成纤维细胞，它们可能存在不同的细胞亚群，因此也对SC进行了分析来评价它们的异质性，揭示了腹囊的间皮细胞和成纤维细胞亚群。空间上差异分布的ECs和SCs亚群体现了不同巨噬细胞种群所在的特定微环境的独特性。
图4 不同物种间的KC细胞鉴定
健康人类肝脏的蛋白质基因组图谱
为了确定这些巨噬细胞及其所处的生态位在小鼠及人的肝脏中的保守程度，研究对19个肝脏组织活检的样本进行了单细胞（单细胞核）及CITE-seq分析。由于先前Visium空间转录组已经体现鼠肝脏细胞定位的准确性，这里使用鼠科肝脏的空间数据对定位组织活检获得的人类肝脏细胞。由于肝部脂肪变性的患者样本于健康样本分开聚集，使用了健康样本来计算基线分区，并将次轨迹转移到脂肪变性样本上。通过分析，确定了这些患者的脂肪变性样本主要位于肝脏中心区，这与先前的临床研究相吻合，即中央周围变性在非酒精性脂肪肝炎患者中最为常见。另外，中性粒细胞，单核细胞及其衍生细胞的分布对脂肪变性区有偏好性，但其整体分布，即在其他区域的分布，并不受到肝脏中央周围脂肪变性的影响。
图5 LAM在健康肝脏和脂肪肝中的分布
KCs在转录组及蛋白质组层面的进化保守性
目前还没有经过完全验证的描述人类KCs的分子标记，原因是单核细胞及巨噬细胞在人类单细胞数据中形成了一个单一的连续体，给简化KCs的定义造成了困难，这种现象也在小鼠中观察到。这种连续体表明在健康的肝组织中，单核细胞也对鉴定到的KC细胞库有所贡献，因此对人类骨髓细胞进行了分析，确定了10个cluster。为了对KC进行定义，在这10个cluster中鉴定了在小鼠中表达最高的25个KC相关基因的表达情况，确定cluster10是真正的人类KC cluster。与小鼠不同，它们的分布对肝中间区域存在偏好性。CITE-seq表明，VSIG4蛋白是人类KC的最佳标记物，也鉴定到了其他的标记物，如FOLR2, CD163和CD169。为了验证KC是否在物种间存在保守性，对猕猴、猪、仓鼠、鸡和斑马鱼的肝脏进行了分析，将保守的人-鼠信号映射到这些多物种数据集上，通过无偏的方式识别KC。在不同物种的KC群体中均观察到核心的KC转录因子基因表达的高度保守，使得物种间的转录模式存在着极高的重叠度，但不同物种仍存在独特的KC基因。在猪和猿猴中的KC群体中，VSIG4的表达也体现了极高的保守性。这项分析还表明，根据保守基因亦可识别跨物种的大多数其他肝细胞。
LAM在人类脂肪变性的肝脏中发生了位置改变
除了KCs，还在肝囊靠近中央静脉和门静脉以及胆管位置上发现了人类CD68+VISIG4-巨噬细胞，在健康的猕猴肝脏中相似的位置也发现了类似的群体。将人类单细胞数据于小鼠特征进行比较，将LAM细胞划分为成熟细胞与非成熟细胞，以定义保守的LAM特征。尽管有研究表明这些细胞是夏卫华肝脏特异性的，但在所有单细胞分析的人类肝脏样本中，均鉴定到了LAM，并且在脂肪变性超过10%的两个样本中，LAM的比例有增加的趋势。与显微镜下观察到的鼠胆管LAM一致，人类LAM位于非脂肪肝的肝门区域，然而在脂肪变性的人类肝脏中，LAM主要分布在中央周围。对小鼠进行脂肪肝诱导后，利用Visium空间数据，也观察到了LAM的这种位置变化。这种变化更多的是保护性的改变，而非病理性。
CD45-肝细胞在决定巨噬细胞分布中的潜在作用
上述的结果中鉴定到了KC及LAM相关的位置改变，因此需要弄清在不同的微环境设定中这些巨噬细胞生态位下的细胞是如何产生差异的。分析人类CD45-细胞也鉴定到了与鼠肝中类似的上皮细胞、基质细胞与肝细胞，但无法找到CD45-细胞位置与KCs位置相关的直接联系。因此分析一些KCs与CD45-细胞间潜在的配体-受体对。这一思路鉴定到LSECs表达的CCL23和CCL14，以及干细胞表达的CCR1可以与KC细胞表达的CCR1结合。这些配体的分布对肝中央周围区域存在偏好性，可以被视作调控KC细胞分布的潜在靶标。
研究还以脂肪肝病变的小鼠模型作为突破口来探讨CD45-细胞与LAM位置分布的关系。在基质细胞中，鉴定到了脂肪肝病变的小鼠中成纤维细胞数目增加。此外，转录层面上观察到了成纤维细胞与星形细胞的重叠，表明了潜在的成纤维细胞与星形细胞间的分化归你。此外还注意到一个成纤维细胞的亚群存在的Ccl2的表达。在肝脏脂肪性病变中招募的单核细胞会存在CCR2的表达，而Ccl2正是CCR2的配体，类似的配体还有Cd44和Vcam1。与星形细胞相关的成纤维细胞在门静脉区富集，而LAM也在此富集。CCL2和Cd44在人类成纤维细胞中存在高表达，体现了它在招募LAM过程中的重要功能。
图6 生态位调控巨噬细胞分布
空间通讯分析
为了鉴定保守的细胞间互作与局部代谢物（如脂质）在推动跨物种巨噬细胞异质性方面的作用。在不同的肝巨噬细胞和存在于各自的生态位中的CD45-细胞间进行了差异NicheNet（细胞间相互作用）分析，着重关注配体在任何小鼠中都饱受的受体。相比于KC是，LAMs中的特定配体-受体对很少，表明LAM表型的主要信号可能不是来自特定的细胞-细胞相互作用。于此一致的是，用乙酰化低密度脂蛋白培养的BM单核细胞存在LAM相关的基因表达，表明脂质在诱导LAM表型中起到了主导作用。对形成KC生态位蓝图的细胞串扰的进一步研究发现，人和小鼠间存在多个保守的配体-受体对。其中一个KCs和星状细胞之间的ALK1-BMP9/10回路在研究提到的7个物种中都是保守的，并与许多保守的KC转录因子表达相关。为了验证这一推测，在小鼠模型中的巨噬细胞敲除了ALK1，导致VSIG4+KCs几乎完全消失，表明ALK1-BMP9/10对肝脏中KC的存在至关重要。
图7 BMP9/10-ALK1回路调控KC发育
小结
对于人类组织的细胞图谱解析以及分析组织上的细胞互作回路研究，主要需要明晰以下的几点信息：（1）精细的细胞分类清单；（2）组织中不同细胞的位置以及相邻细胞间的互作；（3）人类及动物模型间的比对来确定这些预测的互作是否保守；（4）识别可靠的抗体panel便于高效筛选不同的患者或者转基因动物。
总的来说，这篇文章就依照这个思路，层次明晰地尝试回答了上述问题：（1）获得了人和小鼠健康及脂肪性病变的肝脏空间单细胞图谱，识别了不同的细胞类型；（2）通过空间组学联合蛋白质组学技术，确定了关键类型的细胞位置，分析它们间的细胞通讯；（3）跨物种分析这些细胞通讯的保守性；（4）鉴定到了保守的BMP9/10-ALK1回路，调控KC的发育。
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